大豆疫霉菌（Phytophthora sojae）EGFP基因遗传转化载体的构建

论文摘要

由大豆疫霉菌引起的大豆疫霉根腐病是一种分布广泛,危害极其严重的土传性病害,在环境条件有利于病害发生条件下可导致大豆绝产,是影响大豆生产的主要病害之一。由于大豆疫霉菌的土传特性,目前对于大豆疫霉菌的研究有很大的局限性。本论文以真核表达载体pcDNA3.1（-）/hygro为基本骨架,构建大豆疫霉菌遗传转化载体。利用限制性内切酶酶切、去磷酸化、连接等基因重组技术,将增强型绿色荧光蛋白基因和来自莴苣霜霉菌的ham34基因（作为遗传转化载体的启动子）重组到真核表达载体pcDNA3.1（-）/hygro中,经大肠杆菌转化后对转化子进行酶切验证,测序分析,成功构建了用于大豆疫霉菌遗传转化的表达载体pc-EGFP-H2。该表达载体的构建为EGFP基因在大豆疫霉菌中的表达进而达到标记大豆疫霉菌奠定了基础。表达载体pc-EGFP-H2对大豆疫霉菌的转化将会产生一些突变体,这些突变体对于大豆疫霉菌无毒基因和致病基因等研究也具有重要意义。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 大豆疫霉根腐病研究现状
• 1.1.1 大豆疫霉菌的分类地位和特点
• 1.1.2 大豆疫霉根腐病研究状况
• 1.1.3 大豆疫霉根腐病的防治状况
• 1.2 绿色荧光蛋白研究现状
• 1.2.1 绿色荧光蛋白的基础理论研究
• 1.2.2 绿色荧光蛋白的改造
• 1.2.3 绿色荧光蛋白的应用特点
• 1.2.4 影响绿色荧光蛋白表达强度的因素
• 1.2.5 绿色荧光蛋白应用
• 1.2.6 绿色荧光蛋白标记真菌的表达载体
• 1.3 研究的目的与意义
• 2 材料与方法
• 2.1 供试材料
• 2.1.1 质粒与菌株
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 载体构建所用试剂
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 pEGFP-C1 质粒DNA 的提取
• 2.2.2 PCR 扩增EGFP 目的片段
• 2.2.3 PCR 产物的纯化回收
• 2.2.4 质粒载体和EGFP 基因片段的制备
• 2.2.5 EGFP 基因和载体pcDNA3.1（-）/Hygro 的连接
• 2.2.6 连接产物对E.coliDH5α感受态细胞的转化
• 2.2.7 重组质粒DNA 提取及酶切鉴定
• 2.2.8 中间载体pcDNA-EGFP-ham 构建
• 2.2.9 表达载体pc-EGFP-H2 构建
• 2.2.10 表达载体pc-EGFP-H2 基因序列分析
• 3 结果与分析
• 3.1 PEGFP-C1 质粒DNA 提取
• 3.2 PCR 扩增EGFP 目的片段及PCR 产物纯化回收
• 3.3 中间载体PCDNA-EGFP 的构建及酶切鉴定
• 3.3.1 EGFP 基因和载体pcDNA3.1（-）/Hygro 的制备
• 3.3.2 中间载体pcDNA-EGFP 的提取及酶切鉴定
• 3.4 中间载体PCDNA-EGFP-HAM 的构建及酶切鉴定
• 3.4.1 ham34 基因片段和载体pcDNA-EGFP 的制备
• 3.4.2 中间载体pcDNA-EGFP-ham 的提取及酶切鉴定
• 3.5 表达载体PC-EGFP-H2 的构建及酶切鉴定
• 3.5.1 带有NheⅠ粘性末端的载体pcDNA-EGFP-ham 的制备
• 3.5.2 带有NheⅠ粘性末端的ham34 基因片段制备
• 3.5.3 重组质粒pc-EGFP-H2 的提取与鉴定
• 3.6 表达载体PC-EGFP-H2 基因序列分析
• 4 讨论
• 4.1 绿色荧光蛋白
• 4.2 载体的选择
• 4.3 启动子的选择
• 4.4 设计引物考虑的问题
• 4.5 表达载体构建
• 4.6 下一步研究方向
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文