论文摘要
目的ALI/ARDS是一种较为常见的严重急性进行性缺氧性呼吸衰竭,尽管在过去的20年对其防治进行了深入研究,由于其发病机制尚未完全明确,临床上缺乏特效治疗方法,仍以器官功能和全身支持治疗为主,尤其是呼吸支持治疗,故其病死率虽有所下降,但仍高达40%。因此,研究新的治疗策略仍是近年来所关注的热点问题。细胞凋亡在ALI/ARDS发病中起着重要作用。肺泡上皮细胞（AEC）、肺血管内皮细胞（PVEC）凋亡会引起呼吸膜通透性增高,导致渗透性肺水肿、微小肺不张和肺血管阻力增高等改变,是ALI/ARDS发病的关键环节之一。故抑制AEC、PVEC凋亡可能是防治ALI的重要途径和手段。脂多糖（LPS）和TNF-α等可通过激活Caspase-8诱导AEC、PVEC凋亡,而Fas相关死亡域样白介素1-β转换酶抑制蛋白（FLIP）是一种与Caspase-8有显著同源性的抗凋亡蛋白,它可以与Caspase-8竞争性结合FADD,阻断DISC的组装,从而抑制细胞凋亡。本课题组前期体外研究已证实:FLIP重组体腺病毒（Ad-FLIP）可明显抑制经Fas诱导的AEC、PVEC细胞凋亡。为进一步验证Ad-FLIP在动物实验中的抗凋亡保护作用,我们利用Ad-FLIP溶液滴鼻吸入感染大鼠,检测其对肺组织FLIP表达水平的影响并评价对大鼠ALI/ARDS的防治效果;观察其对Ⅱ型AEC、PVEC细胞凋亡的抑制作用并探讨可能的机制。这将为ALI/ARDS的基因治疗提供重要的实验依据。方法1. Ad-FLIP最佳表达时间确定:按滴鼻后处死动物的时间将24只SD大鼠随机分为4组,每组6只。1%戊巴比妥钠50mg/kg腹腔注射麻醉后,予Ad-EGFP腺病毒500ul/kg滴鼻吸入以感染各组SD大鼠,分别于吸入后24h、48h、72h和96h处死各组大鼠,荧光显微镜下观察各组大鼠的肺荧光蛋白EGFP表达。2. Ad-FLIP在体研究动物分组:48只SD大鼠随机分为4组,每组12只。①FLIP治疗组:先经腹腔注射脂多糖（LPS）5mg/kg 4-6h成功制备出内毒素型大鼠ALI模型,之后以1%的戊巴比妥钠50mg/kg充分麻醉,予FLIP腺病毒溶液（2.3×1011vp/ml）500ul/kg滴鼻以感染ALI大鼠;②对照治疗组:建立ALI模型（腹腔注射LPS 5mg/kg 4-6h）后,以Ad-EGFP（3.4×1011vp/ml）腺病毒溶液500ul/kg滴鼻作为对照。③FLIP预防组:先予FLIP腺病毒500ul/kg滴鼻预处理感染SD大鼠,48h后制备大鼠ALI模型;④对照预防组:先予以Ad-EGFP腺病毒吸入作为预防对照,48后制备大鼠ALI模型。3.观察Ad-FLIP对肺组织FLIP表达的影响及ALI/ARDS的防治作用:采用RT-PCR和免疫组织化学染色方法检测各组大鼠的肺组织FLIP mRNA及蛋白表达;观察各组大鼠的一般情况、肺大体标本、肺组织病理学改变,测定各组大鼠的肺呼吸膜的通透性以及肺损伤评分。4.观察各组大鼠的肺组织凋亡状况:透射电镜下观察各组大鼠Ⅱ型AEC、PVEC的凋亡状况;提取肺组织DNA,琼脂糖凝胶电泳观察DNA Ladder的形成;Western Blot和免疫组织化学染色法分别检测各组大鼠的肺组织凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2表达。结果1.荧光显微镜下观察结果提示:Ad-EGFP腺病毒滴鼻吸入能明显提升大鼠的肺组织EGFP黄绿色荧光的表达,其中48h表达最强。2. FLIP治疗组和FLIP预防组大鼠的肺组织FLIP mRNA和蛋白表达水平显著高于其各自对照组（P<0.01）;且大鼠的一般情况较好,肺大体标本和组织病理学改变减轻,肺损伤积分降低（P<0.05）,肺通透性指数亦降低（P<0.01）。3. FLIP治疗组和FLIP预防组大鼠的肺Ⅱ型AEC、PVEC凋亡的细胞数量明显减少,且无明显的DNA Ladder现象。肺组织凋亡相关蛋白Bax水平表达降低,而Bcl-2的表达上调（P<0.01）,Bax/Bcl-2比值降低。结论通过滴鼻吸入的方法能够使大鼠成功地感染Ad-FLIP,并提升其肺组织抗凋亡蛋白FLIP的表达水平;Ad-FLIP无论在制模前或制模后给予均能减轻LPS致大鼠ALI引起的肺水肿和肺血管通透性增高,提示对ALI起到防、治双重作用,其机制可能是通过调节Bax/Bcl-2比值,抑制Ⅱ型AEC、PVEC凋亡来实现的。本研究为ALI/ARDS的基因治疗提供了新的思路。
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