论文摘要
血栓栓塞性疾病是威胁人类健康的一大原因,且其发病率不断升高,对该疾病的研究也就刻不容缓。为了增加现有溶栓药物的溶栓作用及靶向性,本研究主要将溶解血栓的两种天然酶类蛋白(纳豆激酶和蚓激酶)连接于磁性纳米颗粒上,对其连接条件进行优化,产物性质进行表征,并进一步检测了其溶栓活性。此外为了实现体外条件下血栓形成及溶解的微型化、高效化模型检测系统,为血栓栓塞性疾病及治疗药物的研究提供依据和方法,本实验以微流控芯片技术为平台在体外逼真模拟体内血管血栓的形成,并用上述两种溶栓蛋白酶(Nattokinase and Lumbrukinase)进行溶栓行为研究。用EDC将两种重要的溶栓酶(NK和LK)固定于Fe3O4磁性纳米颗粒上,并研究了它们的溶栓活性。用透射电镜,傅立叶变换红外分光镜,振动探针式磁强计,X射线衍射和紫外可见分光光度计对Fe3O4磁性纳米粒子及NK和LK连接的磁性纳米粒子进行性能分析。在405nm和630nm处进行双波长吸光值测定,研究其溶栓活性。通过载药率分析,NK连接的最佳条件为pH6.00,MNPs : protein : EDC的值为2 : 1 : 1;LK连接的最佳条件为pH6.00,MNPs : protein : EDC的值为2 : 1 : 2。溶栓活性试验表明NK连接的磁性粒子溶栓活性可达91.89%,LK可达207.74%,甚至比纯的NK(82.86%)和LK (106.57%)还高。用PDMS制备不同管径的芯片,用注射泵以一定流速注入血小板丰富的血浆和凝血酶,在倒置荧光显微镜下实时观察血栓生成情况。芯片管径越小生成血栓越大且容易堵塞管道,溶解需较长时间;芯片管径越大则生成血栓较细小,溶解时所需时间也较少。在已生成血栓的管径注入不同浓度NK和LK使其溶解,在显微镜下观察其溶解过程,并用CCD照相机取图。通过溶解时间及血栓面积变化情况分析,管径内凝块在高浓度药物作用下溶解较快,2.5 mg/mL NK和LK溶解时间分别为21分钟和12分钟,且同等浓度下,LK的溶解效率比NK高(平均速率分别为23409.5 a.u./min和14208.4 a.u./min)。
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