小麦叶片胞间隙水分胁迫诱导蛋白的分离、纯化及质谱鉴定

论文摘要

细胞间隙液（IWF）中存在许多与植物生长发育相关的物质,为研究植物在逆境胁迫下所发生的生理生化反应提供了重要的资料。本文以“小偃6号”为材料,采用真空渗入离心法,通过设定不同的离心力和时间,提取小麦叶片胞间隙液。提取的胞间隙液经过SDS-PAGE电泳后,用兔抗Rubisco抗体进行Western-blotting试验。结果表明,在离心力为3000g,时间为10,15和20min所提的胞间隙液中均检测到Rubisco大亚基的特异条带。说明在此条件下提取的胞间隙液有细胞器或其它胞内物质的污染。因此,结合其产出量,小麦叶片胞间隙液提取的离心条件应选择为1000-2500g,15-20min。2周龄小麦幼苗用不同浓度PEG-6000模拟干旱处理,1000g,20min提取小麦叶片胞间隙液。测定胁迫2,4,6,8d和复水2d的小麦叶片及胞间隙液中POD、PPO、PAL及几丁质酶的活性,结果表明:随着胁迫强度的增加和处理时间的延长,POD、PPO、PAL（胞间隙除外）、几丁质酶活性均表现上升的趋势,复水2d后下降,但各项指标均没有恢复到对照水平。通过比较胞内、外酶活性大小发现,POD,PAL和PPO活性（处理第2-4d）胞内酶活大于胞间隙,几丁质酶和PPO（第6-8d）则相反。对27.5%PEG处理后的小麦叶片胞间隙液进行SDS-PAGE电泳分析,结果表明,和对照相比,27.5%PEG处理第4,6,8d小麦叶片胞间隙出现分子量约为50kD,36kD和21kD的三种差异蛋白,在处理第4d开始表达,且复水2d后消失,推测这三种蛋白是水分诱导产生的与小麦干旱抗性相关。用电洗脱的方法对50kD蛋白进行纯化,通过MALDI-TOF-MS（基质辅助激光解析电离飞行时间质谱）分析,将所得的PMF（肽指纹图谱）在NCBInr蛋白质数据库中比对,发现的50kD蛋白是一种未知蛋白,有待进一步研究和分析。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 水分胁迫蛋白的分类、特性及其功能
• 1.1.1 功能蛋白
• 1.1.2 调节蛋白
• 1.2 渗透势及渗透调节物质与植物的抗旱性
• 1.2.1 渗透势与植物的抗旱性的关系
• 1.2.2 渗透调节物质与植物的抗旱性
• 1.3 植物细胞间隙的研究现状
• 1.4 Rubisco 的细胞定位
• 1.5 Western-blotting 的研究现状
• 1.5.1 Western-blotting 原理
• 1.5.2 Western-blotting 电转移方法
• 1.5.3 底物的选择
• 1.6 蛋白质回收方法的研究
• 1.7 质谱技术的研究现状
• 1.7.1 基质辅助的激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）
• 1.7.2 液相色谱-质谱/质谱（LC-MS/MS）联用技术
• 1.8 立题依据和实验研究路线
• 第二章 小麦叶片胞间隙液的提取与鉴定
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 供试品种
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.1.4 试剂配制
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 小麦叶片胞间隙液（IWF）的分离
• 2.2.2 IWF 的提取
• 2.2.3 叶片可溶性蛋白的提取和测定
• 2.2.4 胞间隙可溶性蛋白含量测定
• 2.2.5 胞间隙SDS-PAGE 分析
• 2.2.6 Western-blotting
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 不同离心力和离心时间对IWF 的一般性质及产量的影响
• 2.3.2 不同离心条件下小麦叶片胞间隙液SDS-PAGE 电泳图谱
• 2.4 不同离心条件下小麦叶片胞间隙液Western-blotting 图谱
• 2.5 讨论
• 第三章 水分胁迫对几种酶活性的影响
• 3.1 试验材料
• 3.1.1 供试品种
• 3.1.2 试剂
• 3.1.3 主要仪器
• 3.1.4 试剂配制
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 胞间隙液的提取
• 3.2.2 粗酶液的制备
• 3.2.3 过氧化物酶活性测定
• 3.2.4 多酚氧化物酶活性测定
• 3.2.5 苯丙氨酸解氨酶活性测定
• 3.2.6 几丁质酶活性测定
• 3.2.7 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
• 3.2.8 数据处理
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 水分胁迫对 POD 活性及同工酶图谱的影响
• 3.3.2 水分胁迫对 PPO 活性的影响
• 3.3.3 水分胁迫对几丁质酶活性的影响
• 3.3.4 水分胁迫对 PAL 活性的影响
• 3.4 讨论
• 第四章 胞间隙水分胁迫诱导蛋白的表达、纯化及质谱鉴定
• 4.1 试验材料
• 4.1.1 供试材料
• 4.1.2 试剂
• 4.1.3 主要仪器
• 4.1.4 试剂配制
• 4.2 试验方法
• 4.2.1 普通SDS-PAGE 电泳
• 4.2.2 梯度凝胶电泳
• 4.2.3 电洗脱
• 4.2.4 MALDI-TOF-MS 质谱测定
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 PEG 处理后小麦叶片胞间隙液SDS-PAGE 电泳图谱变化
• 4.3.2 50kD 目的蛋白最佳分离条件的确定
• 4.3.3 50kD 蛋白胶回收染-脱色条件的确定
• 4.3.4 小麦叶片胞间隙液50kD 蛋白的纯化
• 4.3.5 MALDI-TOF-MS 质谱测定
• 4.4 讨论
• 第五章 研究的意义、特色、取得的成果
• 5.1 研究的意义
• 5.2 研究的特色
• 5.3 取得成果
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介