苎麻CCoAOMT基因干扰表达载体构建及其遗传转化

论文摘要

咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶（CCoAOMT）是植物木质素合成过程的一种关键酶。运用已克隆的苎麻CCoAOMT基因cDNA,构建成该基因干扰表达载体,分别开展了模式烟草、亚麻和苎麻的遗传转化。以期通过基因表达的干扰作用,降低苎麻和亚麻中CCoAOMT的活性,进而降低其木质素含量,提高纤维品质。以pFGC5941为载体,将苎麻CCoAOMT（BnCCoAOMT）基因cDNA核心区段624 bp序列以相反方向插入其CHS内含子两侧的克隆位点,构建了35S启动子控制的BnCCoAOMT干扰表达重组质粒（pFGC5941-BnCCoAOMTi）,该重组分子在植物中的表达,能拼接成624 bp dsRNA,作为CCoAOMT的干扰分子。为验证CCoAOMT干扰表达抑制木质素含量的可行性,通过农杆菌介导叶盘转化法,先行转化了模式植物烟草WS38,获得了转基因烟草。BnCCoAOMT基因在烟草中的干扰表达,对烟草生长产生了一定影响,转基因植株比对照植株生长较缓慢,其中一株植株表现为茎秆卷曲。叶柄切片的染色分析表明,干扰表达的转基因烟草细胞木质素含量下降。化学分析也证实转基因烟草木质素下降的趋势。鉴于亚麻对pFGC5941载体的选择标记（Bar）的草胺膦（PPT）有较高耐受性,通过载体改造,以潮霉素抗性基因（Hyg）取代草胺膦抗性的选择标记基因,构建具有潮霉素抗性标记的改建干扰表达载体（pFH-BnCCoAOMT）。同样采用根癌农杆菌的共培转化法,对亚麻茎段进行了共培遗传转化。通过潮霉素筛选及分化培养,获得了转BnCCoAOMTi的转基因亚麻。BnCCoAOMT基因干扰表达的转基因亚麻,表型无明显变化,长势和形态与对照基本相同。茎秆切片的染色分析证实,转基因亚麻木质素含量一定程度下降。在上述研究的基础上,开展了苎麻BnCCoAOMTi的转基因研究。目前已获得抗PPT的苎麻愈伤组织。研究结果表明,CCoAOMT基因的干扰表达可以有效抑制转基因植物CCoAOMT活性,降低木质素含量,为利用苎麻CCoAOMT基因开展木质素合成的基因工程调控,培育低木质素或木质素组分改良的苎麻新种质积累了经验。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1 木质素生物合成及其调控的研究进展
• 1.1 木质素的种类和分布
• 1.2 木质素的结构特征及特性
• 1.3 木质素生物合成途径及其重要酶
• 1.4 木质素单体合成途径的多样性
• 1.5 木质素生物合成的基因调控
• 2 RNA干扰研究进展
• 2.1 RNA干扰的分子机制
• 2.2 RNAi的特点
• 2.3 干扰RNA技术在植物基因工程中的应用
• 3 问题与展望
• 4 本研究的课题来源、研究目的与意义
• 第二章 苎麻CCOAOMT基因干扰表达载体的构建及其转化农杆菌
• 1 材料与试剂
• 1.1 菌株和载体
• 1.2 试剂
• 2 实验方法
• 2.1 引物设计及干扰正向和反向目标序列片段的扩增
• 2.2 正、反目标序列BnCCoAOMT的TA克隆、鉴定及其命名
• 2.3 植物干扰表达载体pFGTC5941-BnCCoAOMTi的构建及检测
• 2.4 干扰表达载体pFGC5941-BnCCoAOMTi转化根癌农杆菌LBA4404
• 3 结果与分析
• 3.1 干扰植物表达载体pFGC5941-BnCCoAOMTi的构建流程
• 3.2 正、反目的片段的TA克隆
• 3.3 植物干扰表达载体pFGC5941-rBnCCoAOMT的构建
• 3.4 干扰植物表达载体pFGC5941-BnCCoAOMTi最终构建
• 3.5 干扰表达载体pFGC5941-BnCCoAOMTi转化根癌农杆菌LBA4404
• 4 讨论
• 4.1 RNAi干扰载体靶序列的选择
• 第三章 农杆菌介导苎麻CCOAOMT基因干扰表达载体转化烟草WS38
• 1 材料与试剂
• 1.1 植物材料
• 1.2 菌株
• 1.3 试剂
• 1.4 培养基
• 2 实验方法
• 2.1 农杆菌介导获得转基因植株的技术路线:
• 2.2 烟草试管无菌苗的扩繁:
• 2.3 草胺膦（PPT）选择剂浓度的确定
• 2.4 叶盘法转化烟草
• 2.5 转基因烟草的PCR检测
• 2.6 转基因烟草表型观察
• 2.7 转基因烟草Klason木质素及总纤维素含量的测定
• 2.8 转基因烟草组织切片检测Wiesner反应
• 3 结果与分析
• 3.1 草胺膦（PPT）选择剂浓度的确定
• 3.2 叶盘法转化烟草
• 3.3 转基因烟草的PCR检测
• 3.4 转基因烟草表型观察
• 3.5 转基因烟草Klason木质素及总纤维素含量的测定
• 3.6 转基因烟草组织切片Wiesner反应检测
• 4 讨论
• 4.1 启动子的选择
• 4.2 抑制CCoAOMT表达可以降低转基因植物的木质素含量
• 4.3 关于干扰抑制苎麻CCoAOMT基因对烟草生长的影响
• 4.4 关于Wiesner反应检测
• 第四章 BNCCOAOMT基因干扰载体改建及亚麻转化
• 1 材料与试剂
• 1.1 植物材料
• 1.2 菌株和载体
• 1.3 试剂
• 1.4 培养基
• 2 实验方法
• 2.1 目的片段Hyg+35S的TA克隆、酶切检测及其测序
• 2.2 干扰植物表达载体pFH-BnCCoAOMTi的重新构建及检测
• 2.3 农杆菌介导的亚麻遗传转化体系优化
• 2.4 转基因植株的PCR检测
• 2.5 转基因烟草表型观察
• 2.6 转基因烟草组织切片检测Wiesner反应
• 3 结果与分析
• 3.1 干扰植物表达载体的构建流程
• 3.2 目标序列的测序结果
• 3.3 目的片段的TA克隆
• 3.4 干扰植物表达载体pFH-BnCCoAOMTi目的片段的菌落PCR和双酶切检测
• 3.5 干扰表达载体pFH-BnCCoAOMTi转化根癌农杆菌LBA4404
• 3.6 亚麻胚轴Hyg选择压力的确定
• 3.7 培养基的选择
• 3.8 胚轴预培养对转化的影响
• 3.9 共培养时间对转化的影响
• 600值和侵染时间对转化的影响'>3.10 农杆菌OD₆₀₀值和侵染时间对转化的影响
• 3.11 转基因亚麻中目标序列的PCR检测
• 3.12 转基因亚麻生芽、移栽和表型观察
• 3.13 转基因烟草组织切片Wiesner反应检测
• 4 讨论
• 4.1 关于亚麻直接分化受体系统
• 4.2 关于亚麻对选择抗生素的敏感性
• 4.3 关于亚麻PCR检测
• 第五章 BNCCOAOMT干扰表达载体对苎麻的遗传转化
• 1 材料与试剂
• 2 方法
• 2.1 苎麻外植体的接种及其培养条件
• 2.2 苎麻再生体系的建立
• 2.3 农杆菌介导的苎麻干扰载体遗传转化体系优化
• 2.4 转基因苎麻愈伤组织的PCR检测
• 3 结果分析
• 3.1 不同激素对湘苎二号叶片愈伤诱导的影响
• 3.2 不同激素浓度对不同品种叶片不定芽诱导的影响
• 3.3 不同激素浓度对再生植株生根及移栽的影响
• 3.4 苎麻叶盘Hyg选择压力的确定
• 3.5 延迟筛选对转化的影响
• 3.6 农杆菌介导的苎麻干扰载体遗传转化体系优化
• 3.7 转基因苎麻愈伤组织的观察和PCR检测
• 4 讨论
• 4.1 苎麻再生体系构建的异同
• 4.2 苎麻转化再生的探讨
• 第六章 结论和展望
• 参考文献
• 附录A:缩略词表
• 附录B:主要试剂配制
• 附录C:CAO+35S片段测序报告
• 致谢
• 作者简介