一、骨髓间充质干细胞的分离、培养、鉴定及生物学特性研究（论文文献综述）
李强强,谢亚东,张怀斌,杨国清,梁文强,王勇平[1]（2021）在《SD大鼠骨髓间充质干细胞分离培养及鉴定的实验研究》文中研究指明目的:探讨应用全骨髓贴壁法体外分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）的可行性,研究其生物学特性,为骨组织工程提供种子细胞。方法:取SPF级5周龄健康SD大鼠2只,脱颈处死,分离双下肢股骨、胫骨,全骨髓贴壁法分离培养、纯化BMSCs;通过倒置显微镜观察原代、传代细胞生长情况、绘制生长、贴壁率曲线,研究其生物学特性;流式细胞仪检测表面标志物、诱导成成骨等方法进行鉴定。结果:应用全骨髓贴壁法可在体外分离出活性好、纯度高的BMSCs。倒置显微镜下可见原代细胞呈梭形、多角形,传代细胞形态均一呈纤维样;P3代BMSCs经流式细胞鉴定:CD44、CD90高表达,CD31、CD45低表达;定向诱导向成骨细胞分化,可见明显矿化结节。结论:证实应用全骨髓贴壁培养法体外可成功分离BMSCs,所分离培养、纯化的细胞生物学稳定,纯度高、活性好,具有多向分化潜能,能为骨组织工程、骨质疏松症和骨折不愈合疾病的研究提供种子细胞。
王佳[2]（2021）在《富血小板纤维蛋白对施耐德膜间充质干细胞成骨分化影响的机制研究》文中指出可用骨量不足是上颌后牙区牙列缺损的主要特点,常常给种植体常规植入带来困难。解决这一问题的主要方法是上颌窦底提升术,其原理是采用外科手术方法将上颌窦黏膜从窦底剥离后抬高,在黏膜与窦底骨壁之间植入骨移植材料。然而上颌窦内骨形成的模式一直存在争议,部分学者认为上颌窦内成骨方向是从上颌窦底壁向施耐德膜,而另有部分学者认为施耐德膜也具有成骨潜能,骨形成也可自施耐德膜向上颌窦骨壁发生,理由是上颌窦内牙齿摘除术或上颌窦囊肿摘除术后,可见施耐德膜附近新生的骨质;上颌窦底提升术术中不植入骨移植材料,术后随访仍可见种植体顶端有新骨形成。因此对于施耐德膜的成骨潜能的研究有助于人们了解上颌窦内的成骨模式,为临床中上颌窦底提升术应用新术式提供理论基础。施耐德膜因其固有层存在丰富的毛细血管及结缔组织,可作为间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells,MSCs）的来源。MSC具有自我更新和多向分化的能力,其作为种子细胞被广泛应用于组织工程中。在一定条件下,MSC可被诱导向成骨细胞分化,最终在一定的微环境中形成骨质。富血小板纤维蛋白（Platelet Rich Fibrin,PRF）富含大量促进骨组织再生愈合的生长因子,其致密的三维纤维网结构更是为细胞的长入提供了支架结构。但目前为止,从施耐德膜中分离培养并鉴定间充质干细胞,并以PRF刺激诱导其成骨分化的研究鲜有报道。因此,本研究拟分离培养鉴定施耐德膜间充质干细胞（Sinus Membrane derived Mesenchymal Stem Cells,SMMSCs）,并以PRF刺激诱导其成骨分化,深入探究成骨机制,而后将研究结果应用于临床中,以期为临床工作提供新的思路方法。本研究内容分为4部分实验展开:实验1 SMMSCs的分离培养与鉴定以酶消化法分离培养施耐德膜来源间充质干细胞,流式细胞术鉴定其表面标记物,碱性磷酸酶染色和活力检测,茜素红染色判断其成骨分化能力;油红O染色判断其成脂分化能力;3D悬浮培养,阿利辛蓝染色判断其成软骨分化能力。实验2 PRF对SMMSCs生物学行为的影响对PRF进行扫描电镜观察超微结构,分析其生长因子释放规律。采用CCK-8,RTCA,和细胞荧光染色评价PRF对SMMSCs增殖的影响;细胞划痕实验和Transwell实验评价PRF对SMMSCs迁移的影响;碱性磷酸酶染色和活力检测,茜素红染色,及q PCR评价PRF对SMMSCs成骨诱导分化的影响。通过Western Blot分析PRF对抑制和非抑制状态的ERK 1/2信号通路的调节作用,及其下游的成骨关键因子RUNX2的表达情况。实验3 PRF促进上颌窦内成骨的体内研究构建兔上颌窦底提升术模型,将不同骨移植材料植入上颌窦内,分别于术后第8,12周获取样本,Micro-CT进行影像学评估,判断新生骨量,骨体积分数,骨小梁数量,厚度和离散度。荧光双标记,HE染色,Masson染色,甲苯胺蓝染色等方法评价不同实验组的成骨效果。实验4以PRF为唯一植骨材料进行经牙槽嵴顶入路上颌窦底提升术的临床研究通过前瞻性临床研究,评价内窥镜辅助下以PRF为唯一植骨材料进行经牙槽嵴顶入路上颌窦底提升术（endoscope-assisted maxillary sinus floor elevation with platelet rich fibrin grafting and simultaneous implant placement,PESS）的临床效果,成功率,窦内骨生成量,边缘骨吸收量及骨密度。通过上述实验,得出以下结果:1.成功分离培养SMMSCs,其体外扩增能力强,细胞表面标记物阳性表达间充质干细胞标记物CD90,CD105,阴性表达CD34,CD45,SMMSCs具有成骨、成脂、成软骨多向分化的能力;符合MSC鉴定标准,可被定义为间充质干细胞。2.PRF为致密的三维网状结构,靠近血清侧细胞成分少,靠近红细胞侧,白细胞、血小板含量极为丰富,PRF缓释生长因子血小板衍生生长因子（Platelet-derived Growth Factor,PDGF）,转化生长因子（Transforming Growth Factor-β,TGF-β）,血管内皮细胞生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF）,并可持续释放长达14天;PRF内的生长因子能够刺激SMMSCs的增殖,迁移和成骨分化。PRF可通过上调ERK 1/2信号通路而促进SMMSCs成骨分化。3.PRF能够加速上颌窦内骨组织的形成,并能够增加新骨的形成量,骨移植区成骨标志因子表达明显升高。上颌窦内的成骨方向并不是单纯地自上颌窦底至施耐德膜下,施耐德膜的成骨潜能在此过程中具有一定的作用。4.在1年随访中,通过“PESS”可获得可观的窦内骨增量,种植体生存率高,边缘骨吸收量少,种植体周围骨密度随时间逐渐增加。“PESS”是一种微创、安全、有效的促进窦内新骨形成、缩短治疗周期、扩大经牙槽嵴顶入路上颌窦底提升术治疗适应症的临床方法。
卢惠迪[3]（2021）在《北京油鸡滑膜间充质干细胞的分离培养及鉴定》文中研究表明目的:畜禽遗传资源一直以来都是我国的宝贵财富,是农业生产的基石、人民生活的保障,是我国畜牧业发展中重要的研究资料,家养动物遗传资源的保存应当受到相当的重视。间充质干细胞因其具有自我更新能力和多向分化潜能,在遗传资源的保护与利用和组织工程学等方面取得了广泛认可,从而为畜禽遗传资源的保护提供了新的可能。本实验以北京油鸡滑膜间充质干细胞为试验对象,成功建立了其体外培养体系,并对其生物学特性和诱导分化能力进行研究。方法:使用17日龄北京油鸡种蛋中鸡胚进行SMSCs的分离,通过组织块贴壁法和胶原酶消化法两种方式分离北京油鸡SMSCs,用DMEM-F12+10%FBS+10 ng/m L b FGF+10 ng/m L LIF+2 m M谷氨酰胺+100 IU/m L青、链霉素混合物的完全培养基传代培养,通过绘制细胞生长曲线、计算克隆团形成能力、核型分析、反转录PCR（RTPCR）、免疫荧光鉴定、流式细胞术阳性率分析和诱导分化试验验证北京油鸡SMSCs的生物学特性。结果:北京油鸡SMSCs在体外成功培养至29代,细胞在培养皿中贴壁生长,形态为长梭形。小代次细胞,边界清晰,核质明显,长势良好,折光率高,立体感强;高代次细胞,胞体变大、胞质疏松、边缘模糊,无明显细胞边界、立体感下降、折光效果变差。取P5、P15、P25三个代次的细胞绘制细胞生长曲线,呈现出典型的“S”形生长,通过公式计算可知,P5、P15、P25三个代次细胞的群体倍增时间（PDT）依次为25.30h、26.31h和29.17h,表明细胞的增殖能力会随着细胞代次的升高而降低。通过P5、P15、P25三个代次细胞克隆团形成能力实验结果表明,北京油鸡SMSCs具有自我更新的能力,但是自我更新的能力会随着细胞代次的升高而减弱。核型分析结果表明,染色体形态正常,没有变异情况的发生。RT-PCR鉴定结果表明,细胞表达CD29、CD44、CD73和CD90,不表达CD34和CD45;免疫细胞化学（IF）鉴定结果表明,细胞表达CD29、CD44、CD71、CD73、CD105和CD166,不表达CD34和CD45;流式细胞术表面标记物阳性率分析结果表明,细胞表面标记物CD29、CD44、CD90、CD105和CD166阳性率均在98%以上。北京油鸡SMSCs可在IBMX、胰岛素（INS）、地塞米松和吲哚美辛等因子的作用下,向脂肪细胞诱导分化,脂滴可被油红O染液染为红色,RT-PCR检测,细胞表达LPL与PPARG这两种特异性基因;在地塞米松、β-甘油磷酸钠和抗坏血酸（VC）等因子的作用下向成骨细胞诱导分化,钙结节可被茜素红染液染为红色,经RT-PCR检测,细胞表达COL1A2和RUNX2这两种特异性基因;在胰岛素（INS）、L-脯氨酸、地塞米松、丙酮酸钠、TGF-β3和抗坏血酸（VC）作用下可向成软骨细胞诱导分化,细胞结节可被阿利新蓝染液染为蓝色,经RT-PCR检测,细胞表达COL2A1和VIM这两种特异性基因。诱导分化实验结果表明,北京油鸡SMSCs具有多向分化潜能,可在不同因子的作用下,向脂肪细胞,骨细胞和软骨细胞诱导分化。结论:本试验成功分离出了北京油鸡SMSCs,能在体外稳定传代至P29,并对其进行生物学特性研究和诱导分化能力鉴定,说明其具有自我更新能力和多向分化潜能,在技术上为我国畜禽种质资源保存提供支持,在成果上为国家建立建设种质资源库做出贡献,在创新上为医学、生物学领域研究奠定实验基础。
刘云[4]（2021）在《hESC衍生和组织来源间充质干细胞慢病毒转导GFP基因的特性分析》文中提出目的:1.用pLVX-IRES-Puro-GFP慢病毒转导人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞、人脐带间充质干细胞,流式细胞仪分析慢病毒对三种不同来源人间充质干细胞的转导效率。2.将成功标记绿色荧光蛋白基因的人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞、人脐带间充质干细胞继续传代培养,分析传代培养对绿色荧光蛋白基因阳性的细胞形态及荧光表达的影响。3.测定荧光蛋白标记前后的人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞、人脐带间充质干细胞的增殖、分化及细胞表型,分析慢病毒介导的绿色荧光蛋白转导对人间充质干细胞增殖、分化及细胞表型的影响,为后续干细胞体内示踪奠定基础。方法:1.用相同MOI值pLVX-IRES-Puro-GFP慢病毒转导人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞、人脐带间充质干细胞,流式细胞仪检测三种不同来源人间充质干细胞的慢病毒转导效率。2.将标记有绿色荧光蛋白基因的人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞、人脐带间充质干细胞继续培养传代,观察细胞形态的变化和绿色荧光蛋白基因的表达,流式细胞仪检测细胞增殖10代后绿色荧光蛋白阳性细胞的比例。3.对绿色荧光蛋白标记前后的细胞用CCK-8法测定细胞增殖情况,用定向诱导分化培养液进行成脂、成骨、成软骨诱导分化,油红O、茜素红、阿利新蓝染色液分别对分化后的细胞染色,流式细胞仪测定标记前后细胞表面抗原CD73、CD90、CD105、CD34、CD11b、CD19、CD45和HLA-DR的表达。结果:1.p LVX-IRES-Puro-GFP慢病毒转导人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞、人脐带间充质干细胞的效率存在明显差异,且差异具有显着统计学意义（P<0.01）。结果显示,人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞慢病毒转导效率最高,其次是人脐带间充质干细胞,人脂肪间充质干细胞转导效率最低。2.标记有绿色荧光蛋白基因的人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞、人脐带间充质干细胞继续培养繁殖10代,倒置荧光显微镜下仍然可见几乎所有细胞均带有绿色荧光。自然光线下可见细胞贴壁成梭形,胞质丰富,细胞整体成漩涡状生长,均保持了正常良好的细胞形态,与同代数未转导干细胞比较无明显差异。3.标记有绿色荧光蛋白的人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞、人脐带间充质干细胞的增殖曲线和未标记细胞相近,在450nm波长下测得的OD值无统计学差异（P>0.05）,人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞和人脐带间充质干细胞标记绿色荧光蛋白基因后依然能分化成脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞,流式细胞仪测定表面抗原CD73、CD90、CD105阳性比例均在95%以上,CD34、CD11b、CD19、CD45和HLA-DR几乎不表达（<0.2%）。与同代数未转导干细胞表面抗原表达结果一致。结论:1.p LVX-IRES-Puro-GFP慢病毒转导人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞、人脐带间充质干细胞的效率有显着差异（P<0.01）,分析可能与间充质干细胞来源的不同或细胞增殖力差异等有关。2.标记有绿色荧光蛋白基因的人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞、人脐带间充质干细胞继续培养繁殖10代后细胞形态正常,且绿色荧光蛋白的表达未衰减,提示绿色荧光蛋白基因可在细胞内长期稳定表达,适用于干细胞的长期标记。3.慢病毒GFP基因转导对人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞、人脐带间充质干细胞的生长增殖、分化及细胞表型无不良影响,表明慢病毒介导的绿色荧光蛋白转导对细胞无毒害,且可在细胞内稳定表达,是一种理想的干细胞标记方法。
李强强[5]（2021）在《新型镁合金对骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响及机制研究》文中提出目的:（1）体外分离、培养及鉴定SD大鼠骨髓间充质干细胞的研究;（2）研究新型镁合金对SD大鼠骨髓间充质干细胞功能的影响;（3）研究新型镁合金对SD大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的作用及机制。方法:（1）体外分离、培养及鉴定SD大鼠骨髓间充质干细胞:全骨髓贴壁法分离培养、纯化BMSCs;观察细胞形态,绘制细胞生长、贴壁率曲线;检测BMSCs表面标志物、诱导成骨等方法进行鉴定。（2）新型Mg-Nd-Gd-Sr-Zn-Zr合金对SD大鼠BMSCs功能影响:实验分为5组,分别为无新型Mg-Nd-Gd-Sr-Zn-Zr合金浸提液的对照组,25%、50%、75%、100%浓度的新型Mg-Nd-Gd-Sr-Zn-Zr合金浸提液的实验组。取BMSCs分别与25%、50%、75%、100%浓度的新型Mg-Nd-Gd-Sr-Zn-Zr合金浸提液培养,设立对照组,观察细胞生长情况;研究不同浓度新型Mg-Nd-Gd-Sr-Zn-Zr合金浸提液对BMSCs黏附（CCK-8法）及增殖的影响;同时研究其对BMSCs凋亡的影响。（3）新型Mg-Nd-Gd-Sr-Zn-Zr合金对SD大鼠BMSCs成骨分化作用的研究:将从SD大鼠提取分离的BMSCs培养,实验分为5组,实验组加入含有上述不同浓度新型Mg-Nd-Gd-Sr-Zn-Zr合金浸提液的成骨诱导培养基,对照组加入等量的成骨诱导培养基,培养至第3周,采用茜素红染色法检测矿化能力;培养至第2周,测定碱性磷酸酶活性;荧光定量PCR检测成骨相关基因Runx2、OCN、OPN的表达情况;采用Western blot法检测成骨相关蛋白Runx2、OCN、OPG的表达情况。结果:（1）SD大鼠骨髓间充质干细胞体外分离、培养及鉴定:应用全骨髓贴壁法可在体外分离出纯度高的BMSCs;24小时内BMSCs几乎完全贴壁且细胞贴壁率随培养时间增加而上升,说明其活性良好;BMSCs生长曲线基本符合正常细胞生长曲线;P3代BMSCs经流式细胞鉴定:CD44、CD90高表达,CD31、CD45低表达;定向诱导向成骨细胞分化,可见明显矿化结节。（2）新型Mg-Nd-Gd-Sr-Zn-Zr合金对SD大鼠BMSCs功能影响的研究:（1）细胞黏附:除100%浓度浸提液组外,随着培养时间延长,细胞黏附数量增加;与不含浸提液组比较,1小时、3小时、5小时、7小时浸提液组中,75%浓度浸提液组细胞黏附数量增长最显着,差异有统计学意义（P<0.05）;（2）细胞增殖:第1、3、5、7天,各浸提液细胞数量均高于对照组,75%浓度浸提液最高（P<0.05）;（3）细胞凋亡:流式细胞仪检测结果显示未见明显细胞凋亡（P>0.05）。（3）新型Mg-Nd-Gd-Sr-Zn-Zr合金对SD大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化作用的研究:（1）茜素红染色:5组细胞茜素红染色均有矿化结节形成,与对照组比较,实验组增加明显;（2）碱性磷酸酶活性:新型Mg-Nd-Gd-Sr-Zn-Zr合金浸提液干预SD大鼠BMSCs,第7天和第14天各组ALP活性检测结果示:各组碱性磷酸酶活性第14天高于第7天,与空白组比较,各浸提液组均高于空白组,各组间差异均有统计学意义（P<0.05）。第7天和第14天,75%浓度浸提液组碱性磷酸酶活性最高（P<0.05）;（3）RT-PCR检测成骨相关基因的表达:与无新型Mg-Nd-Gd-Sr-Zn-Zr合金浸提液对照比较,新型Mg-Nd-Gd-Sr-Zn-Zr合金浸提液组成骨相关基因Runx2、OPN、OCN的表达增高（P<0.05）,75%浓度最高,有显着性差异（P<0.05）。（4）Western blot法检测成骨相关蛋白的表达:新型Mg-Nd-Gd-Sr-Zn-Zr合金浸提液各组均能提高成骨相关蛋白OCN、Runx2、OPG的表达（P<0.05）。结论:（1）应用全骨髓贴壁培养法体外可成功分离BMSCs。（2）新型Mg-Nd-Gd-Sr-Zn-Zr合金对SD大鼠骨髓间充质干细胞黏附、增殖具有促进作用,无明显细胞毒性,对其凋亡无明显影响,具有良好的生物相容性。（3）新型Mg-Nd-Gd-Sr-Zn-Zr合金可促进SD大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化。
刘能青[6]（2021）在《不同组织特异性的羊水来源干细胞的生物学特性及在脓毒血症小鼠模型中的治疗研究》文中提出背景:从各种人体组织和器官中可以分离出被称为间充质基质/干细胞（Mesenchymal stromal/stem cells,MSCs）的多能祖细胞,近10年其研究发展迅速,为细胞治疗和再生医学领域的发展提供了源源不断的动力。研究最广泛的MSCs来源包括骨髓、脂肪、脐带和胎盘等。国际细胞治疗协会（International Society for Cellular Therapy,ISCT）对MSCs制定了最低标准,包括细胞能够粘附在塑料皿上,并表达相应的分化簇（CD）标记（例如CD73、CD90和CD105标记）,并且可以在体外进行成脂,成软骨和成骨分化。MSCs的细胞治疗效能主要体现在分化潜能和免疫调剂能力上,特别是免疫调节能力让其在全身多个系统的炎性疾病中都显示出不俗的疗效。羊水中也能分离出与MSCs生物学特性高度一致的细胞,通常被定义为羊水间充质干细胞（Amniotic fluid mesenchymal stem cells,AFMSCs）或羊水来源干细胞（Amniotic fluid stem cells,AFSCs）。一般认为AFSCs介于胚胎干细胞（Embryonic stem cells,ESCs）和MSCs之间的中间阶段细胞,比起传统的MSCs具有更多良好的生物学特,如相比骨髓和脂肪来源的MSCs有更快增殖速度、更广泛的分化潜能、更强的免疫调节能力等。然而AFSCs具有显着的异质性,许多报道表明了AFSCs在细胞形态、分子表型和分化能力等多个方面存在不稳定性。细胞异质性带来的生物学特性的差异,在体外细胞增殖的过程中会进一步把这种差异扩大,进而影响临床细胞治疗效果的稳定性。而AFSCs异质性主要是因为其存在不同的组织器官来源,有研究指出羊水细胞中可以检测出骨髓、皮肤、肾、肝、肺、心等组织器官的特异性标记物。现今为止虽然已经有研究分离了不同组织特异性的AFSCs,但未对其进行深入的生物学特性检测以及临床治疗效能的评估。为此我们拟分离不同组织特异性的AFSCs,从多个角度的评估其生物学特性差异和治疗效能,为解决AFSCs异质性提供可行的思路,为AFSCs临床治疗应用提供更全面深入的理论基础。第一部分不同培养方法分离羊水来源的干细胞及其生物学特性分析目的:建立合适的AFSCs原代和传代培养方案,评估其生物学特性,同时与脐带间充质干细胞进行比较,为后续研究奠定实验基础。方法:1.建立三种培养模式,商品化培养基进行原代和传代培养（AFC）,传统间充质干细胞进行原代和传代培养（MSC）,以及商品化培养基进行原代培养和传统间充质干细胞进行传代培养（AFC-MSC）;2.通过克隆形成实验、CCK-8实验、群体倍增时间检测评估不同培养途径的培养效率;3.流式细胞仪检测细胞表面CD标志物;4.对不同培养途径获得的细胞进行成骨、成脂、成软骨分化,组织特异性染色和分化标志物基因的表达评估分化效果;5.把细胞与激活的外周血单个核细胞（PBMCs）进行共培养,通过CFSE增殖定量分析、增殖标记蛋白的表达及促炎因子的表达评估细胞对PBMCs的抑制能力。结果:1.三种培养途径均能获得AFSCs细胞,但AFC培养途径效率更高,而MSC培养途径更廉价,AFC-MSC培养效率和成本处于两者之间;2.不同培养途径获得的AFSCs在在CD105的表达上存在差异,但不影响细胞形态、多能性基因的表达、分化潜能和免疫抑制能等主要生物学特性;3.与UCMSCs比较,AFSCs具有更高的成骨和成软骨分化能力,更强的免疫调节能力。结论:三种培养途径均可有效获得的AFSCs,CD105表达的差异不影响其他主要生物学特性,并具有比UCMSCs更强的分化潜能和免疫抑制能力。综合考虑时间和资金成本,选择AFC-MSC培养途径更合适。第二部分分离不同组织特异性的羊水来源干细胞并进行生物学特性分析目的:分离出不同组织特异性的AFSCs,从细胞形态、增殖能力、分子表型、多能性基因的表达、分化能力、迁移能力和免疫抑制能力等多个方面分析其差异。方法:1.通过机械挑克隆的方法分离出单个细胞形成的克隆并传代;2.对分离的克隆进行组织标记基因的检测,鉴定出不同组织特异性的AFSCs;3.显微镜下观察细胞形态,群体倍增时间分析增殖能力,β-半乳糖苷酶染色及细胞周期调控标志基因分析衰老程度;4.免疫荧光定性分析胚胎干细胞因子的表达,流式细胞仪定量分析细胞抗原决定簇和多能性因子的表达;5.进行成骨、成脂、成软骨分化,通过分化特异性染色的定性、定量分析及检测分化标志物基因的表达来评估分化程度;6.划痕实验、Transwell实验及检测迁移能力和趋化能力的标志基因评估细胞迁移能力;7.把细胞与激活的PBMCs共培养,通过CFSE细胞增殖实验、增殖标记蛋白的表达和促炎因子基因的表达评估细胞对PBMCs的抑制能力。结果:1.从中孕期羊水分离的AFSCs能表达肺和肾组织特异性标记物,通过分离单细胞克隆并进行鉴定,可以分离出肾特异性AFSCs（AFSCs-K）、肺特异性AFSCs（AFSCs-L）和未知组织特异性AFSCs（AFSCs-X）;2.相比其他两组,AFSCs-K具有更快的增殖速率,更高的CD90、CD105和CD117的表达水平,更好的中胚层三系分化能力和更强的免疫抑制能力。但AFSCs-K具有更强的水平和垂直迁移能力,表达更多的迁移标志物基因,AFSCs-L则表达更多的趋化因子受体。3.分离后的不同组织特异性的AFSCs的各项生物学指标如细胞形态、增殖能力、分子表型、分化潜能等一致性更高,异质性大幅度降低。结论:AFSCs中可以分离出不同组织特异性的细胞,其生物学特性存在差异,总体上AFSCs-X的特性更优。按组织特异性分离后的细胞异质性大幅下降,细胞的各项指标更趋一致。分离不同组织特异性的AFSCs是解决细胞异质性的可行方案第三部分不同组织特异性的羊水来源干细胞对脓毒血症小鼠治疗效能目的:评估不同组织特异性的AFSCs在脓毒血症小鼠模型中的治疗效能。方法:1.使用盲肠穿刺法构建脓毒血症小鼠模型;2.对小鼠进行生存分析,构建生存曲线;3.对血液和腹腔液进行细菌培养,评估AFSCs的抗菌效能;4.Elisa分析血液中促炎因子的表达情况,评估AFSCs的抗炎效能。结果:1.不同组织特异性的AFSCs均能显着改善脓毒血症小鼠的存活率;2.不同组织特异性的AFSCs均能协助机体清除体内细菌,但以AFSCs-X的效果更为显着;3.相比AFSCs-L,AFSCs-K和AFSCs-X更能抑制促炎因子的表达,但两组之间无明显差异。结论:总体上AFSCs能改善脓毒血症生存率,具有抗菌抗炎的效果,其中以AFSCs-X的效果更为明显。
滕兆伟[7]（2021）在《LncRNA 016908调控骨髓间充质干细胞成骨分化影响骨质疏松发病的功能与机制研究》文中进行了进一步梳理[目的]骨质疏松（Osteoporosis,OP）是一种骨量减小、骨组织微结构退化,继而致骨脆性增加、骨折风险剧增的系统性骨病,其所致骨折为老年人致畸致死的主要原因之一[1]。全球OP患者约2亿余,平均每3秒便会新发一例OP所致骨折[2]。伴随老龄化加剧,OP患者数量将进一步呈爆发式增长,给国家和社会带来沉重负担。OP发病率高、危害巨大,发病机制却难以揭示,OP越发成为亟待解决的全球性健康难题。因此,不断深入研究OP发病的分子机制对改善人民的生活质量、提高人民的健康寿命,具有极为重要的战略意义。骨髓间充质干细胞（Hone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）的成骨分化在其发生发展过程中发挥重要作用。长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）对骨髓间充质干细胞成骨分化起重要作用,而外泌体承载多种lncRNA,因而外泌体可能参与骨髓间充质干细胞的成骨分化调控。本课题拟探究骨质疏松患者血浆外泌体是否携载了调控骨髓间充质干细胞成骨分化的lncRNA,拟明确目的基因lncRNA 016908调控骨髓间充质干细胞成骨分化的功能与机制,从而为骨质疏松的精准防治奠定理论基础并提供新思路。[方法]第一部分:提取骨质疏松患者与骨质正常志愿者血浆外泌体,透射电镜观察外泌体形态特征,Western blot检测外泌体标记蛋白CD63、CD81、TSG101的表达,纳米颗粒跟踪分析（Nanosight Analysis,NTA）外泌体粒径大小及分布。外泌体鉴定成功后,提取RNA,通过高通量测序,筛选出差异表达lncRNA;扩大临床样本量,qRT-PCR再次验证lncRNA的表达,筛选出显着高表达目的lncRNA。第二部分:通过基因功能获得与缺失实验,茜素红染色等,验证目的基因lncRNA016908对骨髓间充质干细胞的调控功能;选用高表达lncRNA016908的外泌体孵育骨髓间充质干细胞,验证携载高表达lncRNA 016908的外泌体对骨髓间充质干细胞生物学功能的影响;构建lncRNA 016908过表达载体,合成lncRNA 016908干扰序列siRNA,转染骨髓间充质干细胞,诱导其成骨分化,qRT-PCR、Western blot检测成骨分化相关基因表达情况;茜素红染色实验检测骨髓间充质干细胞成骨分化后的钙沉积情况。过表达骨髓间充质干细胞lncRNA 016908,分析下游mRNA表达谱情况,分析下游蛋白质组表达情况,初探lncRNA 016908可能调控的骨代谢相关信号通路。第三部分:通过核质分离与FISH实验定位目的lncRNA 016908在骨髓间充质干细胞内的定位;采用RNA pull down实验手段,拉取与目的基因lncRNA 016908可能结合的蛋白质,经质谱鉴定后,选取与骨代谢、衰老等相关的目的蛋白质;然后进行RIP实验,反向拉取与目的蛋白结合的RNA,qRT-PCR验证目的基因lncRNA016908的富集情况。通过基因功能获得与缺失实验,茜素红染色等,验证RNA pull down拉到的目的基因真核翻译起始因子 5A2（Eukaryotic translation initiation factor 5A-2,EIF5A2）,是否具有调控骨髓间充质干细胞成骨分化的生物学功能。构建EIF5A2过表达载体,合成EIF5A2干扰序列,转染骨髓间充质干细胞,诱导其成骨分化,qRT-PCR、Western blot检测成骨分化相关基因表达情况;茜素红染色实验检测骨髓间充质干细胞成骨分化后的钙沉积情况。通过挽救实验,验证lncRNA 016908是否通过靶向EIF5A2调控骨髓间充质干细胞成骨分化。过表达lncRNA 016908的同时,沉默EIF5A2,qRT-PCR、Western blot检测成骨分化相关基因表达情况;茜素红染色实验检测骨髓间充质干细胞成骨分化后的钙沉积情况;沉默lncRNA 016908 的同时,过表达 EIF5A2,qRT-PCR、Western blot 检测成骨分化相关基因表达情况;茜素红染色实验检测骨髓间充质干细胞成骨分化后的钙沉积情况。[结果]第一部分:成功获取了大量血浆来源外泌体,经NTA、透射电镜方法以及Western blot检测,其大小、形态、粒径及表面标志物均符合外泌体特征。经高通量测序,筛选到大量差异表达lncRNA,其中lncRNA 016908显着高表达,且经qRT-PCR验证,其稳定高表达于骨质疏松患者血浆外泌体。第二部分:外泌体具有调控骨髓间充质干细胞成骨分化的功能。LncRNA 016908具有抑制骨髓间充质干细胞成骨分化的功能:过表达lncRNA 016908后,成骨分化相关基因OPN、OCN、RUNX2等表达降低,钙沉积减少,骨髓间充质干细胞成骨分化能力减弱;干扰lncRNA 016908表达后,成骨分化相关基因OPN、OCN、RUNX2表达升高,钙沉积增多,骨髓间充质干细胞成骨分化能力增强。第三部分:LncRNA016908主要定位于骨髓间充质干细胞的细胞核;本课题通过RNA pull down实验,拉取到与目的基因lncRNA 016908结合的蛋白质EIF5A2;进一步通过RIP实验与qRT-PCR检测,反向验证到大量lncRNA 016908富集于EIF5A2。EIF5A2具有抑制骨髓间充质干细胞成骨分化的功能:过表达EIF5A2后,成骨分化相关基因OPN、OCN、RUNX2等表达降低,钙沉积减少,骨髓间充质干细胞成骨分化能力减弱;干扰EIF5A2表达后,成骨分化相关基因OPN、OCN、RUNX2等表达升高,钙沉积增多,骨髓间充质干细胞成骨分化能力增强。沉默EIF5A2能够挽救过表达lncRNA 016908导致的骨髓间充质干细胞成骨分化能力减弱,从而增强其成骨分化能力;过表达EIF5A2能够逆转沉默lncRNA016908导致的骨髓间充质干细胞成骨分化能力增强,从而降低其成骨分化能力。[结论]1、携载lncRNA 016908的外泌体具有调控骨髓间充质干细胞成骨分化的功能。2、LncRNA 016908具有抑制骨髓间充质干细胞成骨分化的功能。3、EIF5A2具有抑制骨髓间充质干细胞成骨分化的功能。4、LncRNA 016908可以通过靶向EIF5A2抑制骨髓间充质干细胞成骨分化,进而影响骨质疏松发病。
夏琰[8]（2021）在《人脐带间充质干细胞来源外泌体通过调控血管新生促进大段骨缺损修复的作用及机制研究》文中研究指明研究背景随着现代交通及工业的迅速发展,高能量损伤越来越多。在高能量创伤患者中,严重四肢创伤的比例大量增加,且往往合并大段骨缺损,其治疗一直是临床医生面临的巨大挑战。骨组织工程学的出现和迅速发展,为大段骨缺损的修复开辟了新途径。然而目前临床所使用的各类骨移植材料,对于大段骨缺损修复的临床疗效并不令人满意,关键原因在于移植材料的促血管化能力较弱。在体外及动物实验中,人们已经发现利用干细胞联合骨移植材料可以有效提高骨移植材料的成血管能力,但这类治疗方式仍存在着干细胞来源有限、诱导增殖效率低、免疫排斥反应、潜在致瘤性、伦理争议等问题,临床应用受到极大限制。近年来,随着对干细胞促进组织修复研究的不断深入,人们发现干细胞所产生的外泌体可能在其中扮演了重要的角色,并有望为大段骨缺损的治疗带来新的希望。研究目的本次课题研究拟从人脐带间充质干细胞（umbilical cord mesenchymal stem cells,uMSCs）中分离、提取外泌体(uMSCs-Exosomes,uMSCEXOs),并对其进行鉴定。同时利用微流控技术构建出透明质酸（hyaluronic acid,HA）水凝胶（Hydrogel,Gel）缓释系统,并将外泌体包裹于其中,以期实现对外泌体的有效负载与长效释放。通过动物体内骨折及临界性骨缺损模型,验证uMSCEXOs通过加速血管新生从而促进骨修复的作用;再通过体外细胞实验,进一步验证uMSCEXOs对血管内皮祖细胞成血管分化的影响;最后,通过分子生物学、生物信息学等手段,筛选出uMSCEXOs中的关键性物质,并探索其促进血管新生的内在分子机制,为今后外泌体在大段骨缺损治疗中的应用提供了新的理论依据和研究方向。研究方法1.外泌体的提取、鉴定及外泌体/水凝胶复合体的制备（1）利用超速离心法,从uMSCs和人胚胎肾细胞293（HEK293）中分离、提取外泌体,通过透射电子显微镜、纳米颗粒跟踪分析和Western blotting技术对其进行观察及鉴定。（2）利用微流控技术,以HA为原料,合成制备出HA-Gel,并将上述所提取的外泌体包裹于其中,形成外泌体/水凝胶复合体(uMSCEXOs/Gel或HEK293EXOs/Gel)通过模拟体液浸泡及纳米颗粒跟踪分析技术,检测HA-Gel对外泌体的的负载和缓释性能。2.uMSCEXOs促进骨修复的动物体内实验（1）构建大鼠股骨干横断骨折的动物模型,按照分组(uMSCEXOs/Gel组、HEK293EXOs/Gel组、Gel组),将不同成分的的物质注射至骨折端,术后通过X线、Micro-CT及组织学检查,评价各组的骨折修复情况及骨痂内的血管新生情况;（2）构建大鼠颅骨临界性骨缺损模型,并利用3D打印技术制备了纳米羟基磷灰石/聚己内酯复合支架（nano HA/PCL scaffolds,n HP）。而后根据分组(uMSCEXOs/Gel/n HP组、HEK293EXOs/Gel/n HP组、Gel/n HP组、空白组),将不同成分的的外泌体/水凝胶复合体联合多孔人工骨支架并固化后植入骨缺损区域,术后通过Micro-CT及组织学检查,分析评价各组骨缺损的修复情况及植入区域内的组织成份变化情况;（3）通过上述两部分动物实验,明确uMSCEXOs在本次研究中对骨修复的作用。3.uMSCEXOs对内皮组细胞成血管分化作用的体外实验实验分组:uMSCEXOs组、HEK293EXOs组、Gel组、空白组选择内皮祖细胞（Endothelial Progenitor Cells,EPCs）作为本次课题研究中体外细胞实验部分的研究对象。通过将uMSCEXOs与EPCs共培养来观察外泌体进入细胞的情况;通过CCK-8实验,检测各组细胞增殖的情况;通过Transwell实验、划痕实验来检测各组细胞迁移的情况;通过成管实验,检测各组中细胞血管形成的情况;最后通过RT-PCR技术,检测经干预后,各组EPCs内成血管相关基因的表达变化情况;最终明确uMSCEXOs对EPCs成血管分化的作用。4.uMSCEXOs促进血管新生的机制探索首先采用高通量测序技术,分别对uMSCEXOs和HEK293EXOs中的mi RNAs含量进行测定,并于网上已公布的uMSC的mi RNA含量进行对比,筛选出含量最高的mi RNA,并作为下一步的研究目标;接着构建出不同mi RNA-21表达水平的uMSCEXOs,通过透射电镜和Western blotting的方法对其进行鉴定;再将其作用于EPCs,通过体外成管实验,观察对EPCs血管形成能力的影响;通过鸡胚绒毛尿囊膜实验评价经不同mi RNA-21水平的uMSCEXOs干预后对体内血管生成的影响;最后通过RT-PCR、Western blotting技术检测EPCs内相关基因及蛋白的表达变化,推测潜在的分子机制。研究结果1.外泌体的提取、鉴定及外泌体/水凝胶复合体的制备本部分实验中,使用超速离心技术,从uMSCs及HEK293细胞中分离并提取了外泌体,透射电镜及纳米颗粒跟踪分析显示uMSCEXOs粒径大小约为60-130mm;另外,纳米颗粒跟踪分析结果还显示本研究所分离、提取的uMSCEXOs的浓度为4.2×105个/ml;Western blotting的结果显示,分离出的外泌体其表面特异蛋白CD81、CD63和CD9均显示为阳性。以上实验结果表明我们成功的对外泌体进行了分离和提取。核磁共振氢谱结果显示甲基丙烯酸酐修饰HA成功。所构建的HA-Gel缓释系统被注射在不同形状的模具中后,经紫外线照射,可被固化、塑形为多种形状。接下来的模拟体液浸泡实验,结果显示,将HA-Gel置于模拟体液中浸泡后,其所负载的外泌体会随着水凝胶的降解缓慢释放出来,当浸泡达到20天时,仍有约40%的uMSCEXOs存留于HA-Gel内。2.uMSCEXOs促进骨修复的动物体内实验我们首先成功建立了大鼠股骨干横断骨折模型,按照实验分组,分别在大鼠骨折端处注射含不同成分的物质,术后所有动物切口愈合良好;术后2-4周的X线显示,uMSCEXOs/Gel组的骨痂宽度明显大于对照组;术后2周对骨折端的Micro-CT扫描显示,uMSCEXOs/Gel组骨折端骨痂的骨密度、新生骨体积均高于对照组,同时血管成像也显示uMSCEXOs/Gel组新生血管数量和体积都明显高于对照组;组织学结果显示,uMSCEXO/Gel组中成血管相关蛋白CD31的表达,同样明显高于对照组。接下来,我们又成功建立了大鼠颅骨双侧临界性骨缺损模型,并利用3D打印技术成功制备了纳米羟基磷灰石/聚己内酯复合支架（nano HA/PCL scaffolds,n HP）。按照实验分组,将不同的复合材料植入骨缺损区域内。术后所有动物切口愈合良好;术后4、8周的Micro-CT结果显示,uMSCEXOs/Gel组的骨修复明显优于其余对照组,定量分析同样显示,uMSCEXOs/Gel组的骨密度、新生骨体积、骨小梁密度及厚度值,均明显高于对照各组;术后8周的组织学结果显示,uMSCEXOs/Gel组中可见大量类骨基质及胶原组织长入了材料内部,而对照组则较少新生组织长入,免疫组化的结果进一步显示,在uMSCEXOs/Gel组中,材料内部组织中的成骨及成血管相关蛋白的表达明显强于对照各组。上述体内实验结果表明,在添加了uMSCEXOs后,骨折及骨缺损的修复效果明显得到了增强。3.uMSCEXOs对内皮组细胞成血管分化作用的体外实验本部分实验中,首先将uMSCEXOs与EPCs染色并共培养24小时后,荧光显微镜下可见uMSCEXOs成功进入EPCs内。而后根据实验分组,分别将不同物质EXOs/Gel与EPCs共培养,细胞增殖实验结果显示,相较于对照各组,uMSCEXOs明显促进了EPCs的增殖;Transwell实验和划痕实验的结果显示,uMSCEXOs明显提高了EPCs的迁移能力;成管实验的结果显示,uMSCEXOs/Gel明显提高了EPCs的成管能力;RT-PCR实验结果显示,经uMSCEXOs干预后,EPCs的成血管相关基因（VEGFA、CD31、HIF-1α）的表达相较于对照各组均明显提高,而各对照组之间却未见明显差异。上述体外细胞实验结果表明,在添加了uMSCEXOs后,EPCs的增殖、迁移及成血管化能力得到了显着增强。4.uMSCEXOs促进血管新生的机制探索在本部分实验中,高通量测序的结果显示,uMSCEXOs、HEK293EXOs及uMSCs所包含的mi RNAs特异性显着,仅有mi RNA-21的在uMSCEXOs及uMSCs中都是表达最高的。结合文献报道,我们推测,mi RNA-21很可能是uMSCEXOs产生明显促成血管作用的关键性物质。我们构建了不同mi RNA-21表达水平的uMSCEXOs并对其进行了鉴定。接下来,我们通过体外成管实验、鸡胚绒毛尿囊膜实验、RT-PCR及Western blotting检测,验证了不同mi RNA-21表达水平的uMSCEXOs对EPCs的作用。实验结果显示,当uMSCEXOs中mi RNA-21表达受到抑制时,EPCs的成管能力（成管实验中的新生血管长度及数量、鸡胚绒毛尿囊膜内的新生血管长度及数量）及相关成血管基因、蛋白（VEGFA、HIF-1α）的表达都明显降低,而NOTCH1/DLL4/VEGFA信号通路中NOTCH1及DLL4的表达却明显升高。上述实验结果表明,mi RNA-21在uMSCEXOs促EPCs成血管分化的过程中扮演了关键角色,且可能是通过抑制NOTCH1/DLL4/信号通路并促进VEGFA和HIF-1α的表达发挥作用。研究结论1.通过超速离心技术分离并提取了uMSCs中的外泌体,并通过透射电镜、纳米颗粒跟踪分析及Western blotting技术对其进行了鉴定,验证了uMSCEXOs的正确性,表明超速离心技术是一种安全、可靠、高效的外泌体提取方法;2.通过微流控技术所制备的HA-Gel缓释系统,在模拟体液中浸泡20天后,仍有约40%的外泌体存留于该水凝胶缓释系统内。表明该HA-Gel缓释系统可以实现对外泌体的有效负载与长效释放;3.我们成功建立了大鼠股骨干骨折模型及大鼠颅骨临界性骨缺损模型,并将不同成分的外泌体/水凝胶复合物注射或联合支架移植于骨修复处,术后通过影像学及组织学手段,对比各组的骨修复效果、血管新生情况及手术区域组织内的成分变化,结果显示,在2组动物模型中,含有uMSCEXO组的骨修复效果及血管新生情况均明显优于其余各组,同时含有uMSCEXO的组手术区域内的成血管相关蛋白的表达亦明显高于其余各组。表明uMSCEXO在动物体内,有效的促进了骨折及临界性骨缺损的修复并增强了血管新生的效果。4.通过体外细胞实验（细胞增殖、细胞迁移、小管形成等）,验证了uMSCEXOs能有效地促进内皮祖细胞的增殖、迁移与成血管分化。5.通过高通量测序技术,我们筛选确认mi RNA-21是uMSCEXOs中含量最高的微小非编码核糖核酸。同时,进一步验证了mi RNA-21在uMSCEXOs促进内皮祖细胞有效成血管分化中所起的重要作用,且推测可能是通过调节NOTCH1/DLL4/VEGFA信号通路发挥了作用。
罗雪[9]（2021）在《HCN2和HCN4对骨髓间充质干细胞向具有起搏功能的心肌细胞分化的影响》文中进行了进一步梳理第一部分猪骨髓间充质干细胞（BMSCs）的分离培养和诱导分化目的:通过在体外分离BMSCs,构建一套BMSCs特有的培养方法,并诱导及分化BMSCs,从而建立选择BMSCs最佳流程,从而来探讨BMSCs在生物学中的特性。方法:红细胞裂解法和密度梯度离心法分选是从猪骨髓分离单核细胞两种常用的分离方法,在体外的环境下,将分离获得的单核细胞进行培养,用流式细胞术检测骨髓间充质干细胞表面抗原,以收集的细胞分成BMSC诱导组和对照组,将骨髓间充质干细胞传递至第三代。BMSC诱导组采用不同的诱导方法,加入诱导液,持续7-14天。诱导完成后,观察各组细胞形态。结果:采用骨髓抽吸法采集猪骨髓,充质干细胞来自于猪骨髓中分离获得。采用流式细胞术检测MSCs中CD45、CD11B、CD90的表达情况,结果显示,前两者为阴性,第三个为阳性。由此可见,培养的猪骨髓干细胞符合干细胞的特性。结论:MSCs可以被诱导,分别分化为神经元样细胞、心肌样细胞和脂肪样细胞,由此可见,MSCs能够分化为三层胚胎细胞,为后续进一步诱导做了铺垫。第二部分HCN2和HCN4对骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的影响目的:构建能够使MSCs定向分化为心肌细胞的诱导体系,探讨让心肌细胞能够具有起搏样电流的操作方法,并通过检测起搏通道蛋白的表达情况及If电流动力学特性,探索探讨HCN2和HCN4对骨髓间充质基质细胞（BMSCs）向心肌细胞分化的影响。以获得能够稳定、持久的心肌细胞的诱导机制和方法。方法:以小型成猪为实验对象,提取并分离骨髓间充质干细胞。CD45、CD11B和CD90的细胞表面抗原的表达情况利用流式细胞术来进行检测。对骨髓间充质干细胞进行干预,HCN2+HCN4组:被HCN2和HCN4基因共转染;骨髓间充质干细胞诱导组:被心肌诱导液进行诱导分化。α-actin、cTnT和Desmin是常见的心肌标志物,采用免疫荧光染色和Western blot进行检测。选择全细胞膜片钳技术来检测细胞HCN2通道、HCN4通道电流激活曲线及CsCl对异源表达电流的抑制作用。结果:采用流式细胞术检测CD45、CD11B和CD90的表达情况,结果显示,前两个为阴性,第三个表达为阳性。转染后的HCN2和HCN4基因,免疫荧光染色和Western blot结果显示,HCN2+HCN4组HCN2、HCN4、α-actin和cTnT表达明显增加,可与BMSC诱导组比较。HCN2+HCN4组能够记录与If性质相似的细胞膜通道离子电流。结论:HCN2、HCN4过表达可显着增强MSCs体外向心肌细胞分化的能力,诱导的心肌细胞具有起搏样离子电流。第三部分BMSCs转染HCN1、HCN2和HCN4后诱导为具有起搏样电流细胞的研究目的:研究起搏样细胞的构建方法,并对转染细胞的起搏通道蛋白的表达及If电流动力学特性进行检测,期待能够获得稳定、持久的起搏样细胞。方法:用生物起搏的靶基因HCN1、HCN2、HCN4分别转染到猪MSCs细胞内,把转染后MSCS诱导为具有起博样电流的细胞。结果:用全细胞膜片钳对转染后细胞进行检测,能成功检测出If电流,为建立新型有效的细胞生物起搏技术奠定实验基础。结论:BMSCs转染HCN1、HCN2和HCN4基因后可提高向起搏样细胞诱导分化效率。
胡晓萍[10]（2021）在《绿原酸对牙髓干细胞体外分化成骨的影响及机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景:牙周病（periodontal disease,PD）是导致成年人牙周骨质吸收,牙齿丧失的主要口腔疾病之一。我国成年人约80%～90%患有牙周病,其中重度牙周病患者占人群的5%～20%。而目前牙周病的治疗,仅局限于彻底去除感染,对牙槽骨的修复却非常有限。如何有效地修复牙槽骨,尽可能地保留牙齿一直是个临床难题。组织工程学为牙槽骨缺损的修复提供了一条新的途径。种子细胞是组织工程学的三大要素之一。牙髓干细胞（dental pulp stem cells,DPSCs）是理想的种子细胞,其来源广,取材方便,增殖快,体外克隆能力强,可诱导分化成骨。牙髓干细胞免疫原性低,暂未发现明显致瘤性。绿原酸（chlorogenic acid,CGA）是传统中药金银花和杜仲的主要有效成分之一,在医药,食品,化妆品以及保健品行业都有广泛应用。绿原酸具有抗菌、止血、升高白细胞和利胆等药理作用,且可诱导骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchyml stem cell,BMSCs）增殖及分化成骨。因此,本实验旨在研究绿原酸对牙髓干细胞分化成骨的作用,及其对相关信号通路的影响,以揭示其作用机制,以期为进一步研究牙周病患者牙槽骨缺损的修复寻找新的方法和奠定实验基础。研究方法:本实验将牙髓干细胞进行分离、培养及鉴定;用不同浓度的绿原酸（0.1μg/m L、1μg/m L、10μg/m L、100μg/m L、1 mg/m L）作用于牙髓干细胞,MTT法检测绿原酸对牙髓干细胞增殖的影响;茜素红染色检测绿原酸对牙髓干细胞成骨能力的影响:设立对照组、成骨诱导培养液组（OSI组）和成骨诱导培养液+含不同浓度绿原酸组（0.1μg/m L、1μg/m L、10μg/m L、100μg/m L）（CGA组）,分别处理牙髓干细胞。21天后结束成骨诱导,将各组牙髓干细胞进行茜素红染色。转录组测序（RNA-seq）检测绿原酸对牙髓干细胞基因表达的影响。将牙髓干细胞分为3组:CGA组（成骨诱导培养液+绿原酸（10μg/m L）培养）、OSI组（成骨诱导培养液培养）和对照组（n=3）。在成骨诱导21天后,采用转录组测序检测各组细胞差异表达基因。对转录组测序结果进行生物信息学分析筛选出差异表达基因,进行GO（Gene Ontology）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）信号通路显着性富集,分析差异表达基因参与的功能类别和信号通路。实时荧光定量PCR技术（q RT-PCR）验证绿原酸对牙髓干细胞成骨相关基因:卷曲相关蛋白（frizzled-related protein,FRZB）、丙酮酸脱氢酶激酶4（pyruvate dehydrogenase kinase 4,PDK4）、无孢蛋白（asporin,ASPN）和细胞因子样蛋白-1（cytokine like 1,CYTL1）表达的影响。蛋白质免疫印迹分析（western blot）检测FRZB的蛋白水平,分析绿原酸对经典Wnt/β-catenin信号通路活性β-catenin和总β-catenin蛋白表达量和非经典Wnt/Ca2+信号通路钙调蛋白依赖激酶II（Cam KII）、磷酸化Cam KII（p Cam KII）camp-反应元件结合蛋白（CREB）和磷酸化CREB（p CREB）蛋白表达的影响。结果:MTT实验表明,牙髓干细胞的增殖对绿原酸表现出剂量依赖性。中低浓度时,牙髓干细胞的增殖随着绿原酸浓度的升高而增加。而当绿原酸浓度为1mg/m L,干预时间超过48小时,绿原酸对牙髓干细胞的增殖具有抑制作用。茜素红染色实验表明随着绿原酸浓度的升高,其促进牙髓干细胞成骨的能力增强。但当绿原酸浓度升高为100μg/m L时,其促成骨作用开始受到抑制。转录组测序、生物信息学分析和q RT-PCR结果表明绿原酸可以促进成骨基因卷曲相关蛋白（FRZB）、丙酮酸脱氢酶激酶4（PDK4）的表达,抑制破骨基因无孢蛋白（ASPN）、细胞因子样蛋白-1（CYTL1）的表达。蛋白质免疫印迹法分析表明绿原酸提高了FRZB的蛋白水平,还导致了活性β-catenin和总β-catenin蛋白水平的降低,而钙调蛋白依赖激酶II（Cam KII）、磷酸化Cam KII（p Cam KII）和磷酸化camp-反应元件结合蛋白（p CREB）的蛋白水平均增加,但camp-反应元件结合蛋白（CREB）的蛋白水不变。结论:中低浓度的绿原酸可促进牙髓干细胞增殖和成骨分化;促进成骨基因FRZB、PDK4的表达和抑制破骨基因ASPN、CYTL1的表达;抑制经典Wnt/β-catenin信号通路,增强非经典Wnt/Ca2+信号通路;本实验提示绿原酸可通过调控成骨相关基因和Wnt信号通路促进牙髓干细胞的成骨分化。
二、骨髓间充质干细胞的分离、培养、鉴定及生物学特性研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、骨髓间充质干细胞的分离、培养、鉴定及生物学特性研究（论文提纲范文）
（1）SD大鼠骨髓间充质干细胞分离培养及鉴定的实验研究（论文提纲范文）
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂与仪器 |
| 1.3 全骨髓贴壁法体外分离培养SD大鼠原代BMSCs |
| 1.4 SD大鼠BMSCs传代培养及纯化 |
| 1.5 SD大鼠BMSCs冻存与复苏 |
| 1.6 SD大鼠BMSCs贴壁率的绘制[18] |
| 1.7 SD大鼠BMSCs不同代生长曲线的绘制[20] |
| 1.8 SD大鼠BMSCs表面标志物的鉴定 |
| 1.9 SD大鼠BMSCs多向分化能力的鉴定 |
| 2 结果 |
| 2.1 SD大鼠BMSCs形态学观察 |
| 2.2 SD大鼠BMSCs贴壁率 |
| 2.3 SD大鼠BMSCs不同代生长曲线 |
| 2.4 SD大鼠BMSCs表面标志物的鉴定结果 |
| 2.5 SD大鼠BMSCs多向分化能力的鉴定结果 |
| 3 讨论 |
（2）富血小板纤维蛋白对施耐德膜间充质干细胞成骨分化影响的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 施耐德膜间充质干细胞的研究进展 |
| 1.2 富血小板纤维蛋白的研究进展 |
| 1.3 成骨相关信号通路的调控 |
| 1.4 课题研究意义 |
| 第2章 施耐德膜间充质干细胞的分离培养与鉴定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 仪器设备和主要试剂 |
| 2.2.2 方法 |
| 2.3 统计学分析 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 SMMSCs的形态和增殖规律分析 |
| 2.4.2 SMMSCs表面标记物鉴定 |
| 2.4.3 SMMSCs成骨诱导分化能力检测 |
| 2.4.4 SMMSCs成脂诱导分化能力检测 |
| 2.4.5 SMMSCs成软骨诱导分化能力检测 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第3章 PRF对施耐德膜间充质干细胞生物学行为的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 仪器设备和主要试剂 |
| 3.2.2 方法 |
| 3.3 统计学分析 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 PRF的结构及生长因子释放规律 |
| 3.4.2 PRF条件培养基对SMMSCs及 BMSCs增殖的影响 |
| 3.4.3 PRF条件培养基对SMMSCs及 BMSCs迁移的影响 |
| 3.4.4 PRF条件培养基对SMMSCs及 BMSCs成骨分化的影响 |
| 3.4.5 PRF对 BMSCs和 SMMSCs ERK 1/2及p-ERK 1/2 蛋白表达水平的影响 |
| 3.4.6 抑制ERK 1/2 信号通路后PRF对 BMSCs和 SMMSCs ERK 1/2 及p-ERK 1/2 蛋白表达水平的影响 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第4章 PRF促进上颌窦内成骨的体内研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 仪器设备和主要试剂 |
| 4.2.2 方法 |
| 4.3 统计学分析 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 影像学结果 |
| 4.4.2 新骨成骨标志基因的表达水平 |
| 4.4.3 双荧光染色分析 |
| 4.4.4 HE,Masson,甲苯胺蓝染色分析 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 第5章 以PRF为唯一植骨材料进行经牙槽嵴顶入路上颌窦底提升术的临床研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 主要仪器设备 |
| 5.2.2 方法 |
| 5.3 统计学分析 |
| 5.4 结果 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 本章小结 |
| 第6章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（3）北京油鸡滑膜间充质干细胞的分离培养及鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 我国畜禽遗传资源现状 |
| 1.2 间充质干细胞的研究进展 |
| 1.3 滑膜间充质干细胞的研究进展 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 试验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 北京油鸡SMSCs分离与培养 |
| 3.2 北京油鸡SMSCs生长曲线 |
| 3.3 北京油鸡SMSCs克隆形成能力的检测 |
| 3.4 北京油鸡SMSCs核型分析 |
| 3.5 北京油鸡SMSCs表面标记物检测 |
| 3.6 北京油鸡SMSCs的诱导分化 |
| 4 讨论 |
| 4.1 北京油鸡SMSCs分离培养 |
| 4.2 北京油鸡SMSCs的生物学特性 |
| 4.3 北京油鸡SMSCs的诱导分化 |
| 4.4 SMSCs的应用前景 |
| 4.5 SMSCs研究中存在的问题 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 英文缩写 |
| 攻读学位期间发表的学术成果 |
（4）hESC衍生和组织来源间充质干细胞慢病毒转导GFP基因的特性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 前言 |
| 第一部分 pLVX-IRES-Puro-GFP慢病毒载体的构建及转导hESC-MSC、hADSC、hUC-MSC |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 pLVX-IRES-Puro-GFP慢病毒的包装 |
| 2.2 慢病毒转导hESC-MSC、hADSC、hUC-MSC的情况 |
| 3 讨论 |
| 3.1 pLVX-IRES-Puro-GFP慢病毒载体的构建 |
| 3.2 慢病毒转导hESC-MSC、hADSC、hUC-MSC的转导效率 |
| 4 结论 |
| 第二部分 GFP+MSCs细胞系的建立及培养与传代 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 GFP+MSCs的形态观察和GFP表达情况 |
| 2.2 GFP+MSCs的培养和传代 |
| 3 讨论 |
| 3.1 GFP+MSCs细胞系的建立 |
| 3.2 GFP+MSCs的传代和培养 |
| 4 结论 |
| 第三部分 hESC-MSC、hADSC、hUC-MSC标记GFP基因前后特性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 MSCs标记GFP基因前后增殖力比较 |
| 2.2 MSCs标记GFP基因前后体外诱导分化情况 |
| 2.3 MSCs标记GFP基因前后细胞表型鉴定 |
| 3 讨论 |
| 3.1 MSCs标记GFP基因前后增殖力比较 |
| 3.2 MSCs标记GFP基因前后体外诱导分化能力评估 |
| 3.3 MSCs标记GFP基因前后细胞表型的表达情况 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 荧光蛋白法标记在间充质干细胞中的应用进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（5）新型镁合金对骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词量表 |
| 前言 |
| 第一部分 SD大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 SD大鼠BMSCs形态学观察 |
| 2.2 SD大鼠BMSCs贴壁率 |
| 2.3 SD大鼠BMSCs不同代生长曲线 |
| 2.4 SD大鼠BMSCs表面标志物的鉴定结果 |
| 2.5 SD大鼠BMSCs多向分化能力的鉴定结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 新型镁合金对骨髓间充质干细胞功能影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 SD大鼠BMSCs细胞黏附 |
| 2.2 SD大鼠BMSCs细胞增殖 |
| 2.3 SD大鼠BMSCs细胞毒性 |
| 2.4 SD大鼠BMSCs细胞凋亡 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 新型镁合金对骨髓间充质干细胞成骨分化作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 矿化结节检测 |
| 2.2 碱性磷酸酶活性测定 |
| 2.3 成骨相关基因表达 |
| 2.4 成骨相关蛋白表达 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四部分 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 骨髓间充质干细胞成骨分化的研究进展 |
| 参考文献 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（6）不同组织特异性的羊水来源干细胞的生物学特性及在脓毒血症小鼠模型中的治疗研究（论文提纲范文）
| 缩略词英中文索引 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言总论 |
| 第一部分 不同培养方法分离羊水来源的干细胞及分析其生物学特性 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 分离不同组织特异性的羊水来源干细胞并进行生物学特性分析 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 不同组织特异性的羊水来源干细胞对脓毒血症小鼠治疗效能 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 基于分化潜能和免疫调节特性的羊水来源干细胞的治疗潜力 |
| 参考文献 |
| 附录 研究技术路线图 |
| 硕士研究生在读期间发表的论文及个人奖励 |
| 致谢 |
（7）LncRNA 016908调控骨髓间充质干细胞成骨分化影响骨质疏松发病的功能与机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 骨质疏松患者血浆外泌体提取、鉴定、长链非编码RNA测序分析 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1. 临床样本入组标准 |
| 2. 材料与仪器 |
| 3. 实验方法 |
| 结果 |
| 1. 血清外泌体的鉴定 |
| 2. 外泌体lncRNA测序 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 LncRNA 016908调控骨髓间充质干细胞成骨分化 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1. 材料与仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 结果 |
| 1. 间充质干细胞的分离及鉴定 |
| 2. 外泌体孵育BMSCs |
| 3. LncRNA 016908抑制骨髓间充质干细胞成骨分化 |
| 4. LncRNA 016908下游mRNA表达谱 |
| 5. LncRNA 016908下游蛋白质表达谱 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 LncRNA 016908协同EIF5A2调控骨髓间充质干细胞成骨分化的分子机制 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1. 材料与仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 结果 |
| 1. LncRNA 016908定位 |
| 2. LncRNA 016908互作蛋白鉴定及筛选 |
| 3. RIP验证lncRNA 016908与EIF5A2互作 |
| 4. EIF5A2调控BMSCs成骨分化中的作用 |
| 5. Rescue实验验证EIF5A2对BMSCs成骨分化的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 非编码RNA在骨质疏松发病机制中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（8）人脐带间充质干细胞来源外泌体通过调控血管新生促进大段骨缺损修复的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 课题设计 |
| 第一部分 外泌体的提取、鉴定及外泌体/水凝胶复合体的制备 |
| 一、材料和方法 |
| 二、结果 |
| 第二部分 ~(uMSC)EXOs促进骨修复的动物体内实验 |
| 一、材料和方法 |
| 二、结果 |
| 第三部分 ~(uMSC)EXOs对内皮组细胞成血管分化作用的体外实验 |
| 一、材料和方法 |
| 二、结果 |
| 第四部分 ~(uMSC)EXOs促进血管新生的机制探索 |
| 一、材料和方法 |
| 二、结果 |
| 分析与讨论 |
| 结论及意义 |
| 综述一:干细胞衍生外泌体:一种促进骨折愈合的有效策略 |
| 综述二:基于水凝胶的支架在组织工程应用中的生物相容性 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文和参加科研工作情况说明 |
| 致谢 |
（9）HCN2和HCN4对骨髓间充质干细胞向具有起搏功能的心肌细胞分化的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 猪骨髓间充质干细胞(MSCS)的分离培养诱导分化 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 主要实验仪器与材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2. 实验结果 |
| 2.1 猪骨髓间充质干细胞(MSCs)诱导神经元样细胞 |
| 2.2 猪骨髓间充质干细胞(MSCs)诱导脂肪细胞 |
| 2.3 猪骨髓间充质干细胞(MSCs)诱导心肌细胞 |
| 3. 讨论 |
| 第二部分 HCN2和HCN4对骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 骨髓干细胞(BMSCs)提取 |
| 1.2 流式细胞术检测骨髓间充质干细胞表面抗原 |
| 1.3 骨髓间充质干细胞的分化和分组 |
| 1.4 免疫荧光染色 |
| 1.5 免疫印迹 |
| 1.6 全细胞膜片钳技术 |
| 1.7 统计分析 |
| 2. 结果 |
| 2.1 猪骨髓间充质干细胞的分离与鉴定 |
| 2.2 HCN2和HCN4可显着增加骨髓间充质干细胞向心肌细胞的体外分化 |
| 2.3 HCN2和HCN4恢复体外培养的BMSCs细胞的离子电流 |
| 3. 讨论 |
| 4. 结论 |
| 第三部分 HCN1、HCN2和HCN4转染BMSCS后诱导为具有起搏样电流细胞的研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 主要实验仪器和材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2. 结果 |
| 2.1 转染后MSCs用全细胞膜片钳记录稳定转染HCN阳性干细胞起搏离子通道电流 |
| 2.2 HCN2和HCN4联合转染后MSCs诱导为起搏样细胞的形态 |
| 3. 讨论 |
| 本实验的不足和未来展望 |
| 参考文献 |
| 综述 HCN通道与心脏生物起搏研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（10）绿原酸对牙髓干细胞体外分化成骨的影响及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第1章 引言 |
| 第2章 牙髓干细胞的培养和鉴定 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 仪器设备 |
| 2.1.2 试剂与材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 细胞取材 |
| 2.2.2 牙髓干细胞的分离与原代培养 |
| 2.2.3 牙髓干细胞的传代及纯化 |
| 2.2.4 牙髓干细胞的冻存与复苏 |
| 2.2.5 牙髓干细胞的鉴定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 牙髄干细胞的形态 |
| 2.3.2 牙髓干细胞表面分子标记物 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 牙髓干细胞的培养 |
| 2.4.2 牙髓干细胞的分离纯化 |
| 2.4.3 牙髓干细胞的鉴定 |
| 第3章 绿原酸对牙髓干细胞增殖和成骨分化的影响 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 仪器设备 |
| 3.1.2 试剂和材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 MTT法检测细胞的增殖 |
| 3.2.2 茜素红染色检测细胞的成骨分化 |
| 3.2.3 统计分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 绿原酸对牙髓干细胞增殖的影响 |
| 3.3.2 绿原酸对牙髓干细胞成骨分化的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 绿原酸促进牙髓干细胞成骨分化的分子机制 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 仪器设备 |
| 4.1.2 试剂与材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 转录组测序及生物信息学分析 |
| 4.2.2 实时荧光定量PCR验证实验 |
| 4.2.3 蛋白质免疫印迹分析 |
| 4.2.4 统计分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 绿原酸促进牙髓干细胞成骨分化 |
| 4.3.2 转录组测序结果和生物信息学分析 |
| 4.3.3 转录组测序筛选的差异表达基因的验证 |
| 4.3.4 相关通路检测 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 进一步工作的方向 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 牙髓干细胞成骨分化能力的研究进展 |
| 参考文献 |
四、骨髓间充质干细胞的分离、培养、鉴定及生物学特性研究（论文参考文献）
- [1]SD大鼠骨髓间充质干细胞分离培养及鉴定的实验研究[J]. 李强强,谢亚东,张怀斌,杨国清,梁文强,王勇平. 现代生物医学进展, 2021
- [2]富血小板纤维蛋白对施耐德膜间充质干细胞成骨分化影响的机制研究[D]. 王佳. 吉林大学, 2021(01)
- [3]北京油鸡滑膜间充质干细胞的分离培养及鉴定[D]. 卢惠迪. 佳木斯大学, 2021(12)
- [4]hESC衍生和组织来源间充质干细胞慢病毒转导GFP基因的特性分析[D]. 刘云. 山西医科大学, 2021(01)
- [5]新型镁合金对骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响及机制研究[D]. 李强强. 兰州大学, 2021(09)
- [6]不同组织特异性的羊水来源干细胞的生物学特性及在脓毒血症小鼠模型中的治疗研究[D]. 刘能青. 广州医科大学, 2021
- [7]LncRNA 016908调控骨髓间充质干细胞成骨分化影响骨质疏松发病的功能与机制研究[D]. 滕兆伟. 昆明医科大学, 2021
- [8]人脐带间充质干细胞来源外泌体通过调控血管新生促进大段骨缺损修复的作用及机制研究[D]. 夏琰. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(01)
- [9]HCN2和HCN4对骨髓间充质干细胞向具有起搏功能的心肌细胞分化的影响[D]. 罗雪. 扬州大学, 2021(08)
- [10]绿原酸对牙髓干细胞体外分化成骨的影响及机制研究[D]. 胡晓萍. 南昌大学, 2021(01)