鹿茸多肽纳米复合材料对成骨细胞及骨愈合的影响

论文摘要

临床上由于创伤、肿瘤、感染所造成的骨缺损很常见,目前缺乏较为理想的植骨材料：自体骨移植常受到自身供体有限性的限制以及术后供区损伤、感染等并发症,异体骨主要存在移植后的免疫排斥反应及传播疾病等问题。组织工程学的问世为人体组织器官缺损的再造和修复开辟了新的途径。模仿天然骨的成分和结构特征制造的骨替代材料,可为细胞提供与天然骨相类似的微环境。β-磷酸三钙（Beta-tricalcium phosphate, P-TCP）因其具有良好的生物相容性和成骨活性,在水溶液和体液中的溶解度是羟基磷灰石（HAP）的10-15倍,能够克服HAP在体内的降解问题而成为骨组织修复领域的主要研究对象。但因脆性大和不易成型的缺点,严重制约了其在临床上的应用。将p-TCP与具有良好韧性的有机物复合,形成无机/有机复合生物材料,既可以解决p-TCP的脆性问题,也可以利用有机物来提高材料的生物学活性。纳米β-磷酸三钙是利用纳米技术在纳米结构单元或纳米数量级（1～100nm）下生产的新型材料,具有小尺寸效应、表面效应,可以在三维空间上提高材料的强度。胶原是人体骨组织中的主要有机成分,在体内可以明显增进细胞间的相互作用,如细胞趋化、细胞增殖等。明胶是胶原蛋白的水解产物,具有与胶原相同的氨基酸,良好的生物相容性,同时还具有较好的黏附作用和骨诱导性,可被人体降解吸收以及较低的免疫原性。鹿茸多肽为鹿茸的主要药理活性成分,具有促进骨髓间质细胞分化,软骨细胞、表皮细胞及成纤维细胞增殖等作用,可明显加速骨组织再生、周围神经组织再生及创面愈合。将鹿茸多肽复合到纳米磷酸三钙明胶微球中不仅可以发挥纳米磷酸三钙材料的骨传导性又可以解决多肽类药物不易通过生物屏障,在伤口及创面易被水解酶破坏等问题,可以持续、稳定、高效地控制鹿茸多肽药物的释放速度,延长半衰期,实现药物的靶向释放,大幅度提高药物的生物利用度,从而达到修复骨缺损与药物治疗的双重效果。基于以上认识,本实验研制了鹿茸多肽纳米复合材料。实验分五个部分进行观察研究：1.鹿茸多肽纳米复合材料的制备及性能研究利用反相微乳液法制备了鹿茸多肽纳米复合材料（nano TCP/gel/VAP）,扫描电镜观察纳米复合微球形态,SELDI-TOF-MS质谱仪检测复合材料的组成成分。2.鹿茸多肽纳米复合材料的生物相容性评价研究根据国际标准化组织（IS010993）我国（GB/T 16886）对于生物材料相容性的测试要求,通过急性毒性实验、溶血实验、细胞增殖实验和细胞毒性实验研究复合材料的生物安全性。3.鹿茸多肽纳米复合材料对成骨细胞生物学特性的影响采用MTT比色法、茜素红染色方法检测nano TCP/gel/VAP对体外培养人成骨细胞的增殖、细胞分泌细胞外钙基质的影响；采用全自动生化分析仪检测成骨细胞碱性磷酸酶活性,通过电镜形态学观察复合材料对受损成骨细胞的影响。4.鹿茸多肽纳米复合材料对兔下颌骨缺损修复影响的实验研究建立兔下颌骨缺损模型,通过鹿茸多肽纳米复合材料和单纯的纳米复合材料置兔下颌骨缺损处,术后4、8、12周时通过表面观察、Micro-CT、组织病理学和扫描电镜观察评价鹿茸多肽纳米复合材料的骨修复效果。5.鹿茸多肽纳米复合材料促成骨细胞早期分化机制的初步研究通过p38MAPK信号转导阻断剂SB203580对成骨细胞增殖的影响与鹿茸多肽纳米复合材料对SB203580作用下成骨细胞分泌ALP、ColⅠmRNA表达的影响,观察鹿茸多肽纳米复合材料在成骨细胞早期分化过程中的作用。实验获得以下主要结果和结论：1.本研究研制了鹿茸多肽纳米复合材料（nano TCP/gel/VAP）,扫描电镜观察纳米复合微球形貌良好,直径约20～40μm,具有高度的分散性和均一性,微球表面有纳米级孔洞；通过质谱分析,检测到明胶分子与鹿茸多肽的存在,鹿茸多肽通过静电作用包覆于明胶微球内部。微球形貌规则、尺寸可控,通过调节微球的尺寸可以满足不同骨修复的需要。2.根据国际标准化组织（ISO10993）和我国（GB/T 16886）对于生物材料相容性的测试要求,证明鹿茸多肽纳米复合材料无细胞毒性,无急性毒性,不引起溶血反应,符合相应的标准要求,具有良好的生物安全性。3.鹿茸多肽纳米复合材料可以促进人成骨细胞的黏附、增殖,并促进成骨细胞分泌细胞外基质和形成钙结节,促进成骨细胞的分化成熟,对受损的成骨细胞有保护和修复的作用。4.鹿茸多肽纳米复合材料修复兔下颌骨缺损术后12周,nano TCP/gel/VAP组的骨缺损由骨组织修复,空白对照组的则由纤维组织覆盖,nano TCP/gel组介于上两组之间,边缘是骨组织覆盖,而中心区是纤维组织。Micro-CT检查显示,复合材料组优于空白对照组,nano TCP/gel/VAP组优于nano TCP/gel组。组织学观察nano TCP/gel/VAP组见致密的板层骨,可见哈佛管系统,髓腔再通,板层骨与原骨组织紧密结合；nano TCP/gel组为编织骨修复,缺损中心仍为纤维组织；空白对照组在缺损周边部位可见极少骨岛生成,中心部位仍由纤维组织填充。扫描电镜观察nano TCP/gel/VAP组,为致密的骨样组织,nano TCP/gel组新生骨组织与边界融合不紧密,孔隙较多,结构疏松。空白对照组未见骨组织生成,仍为纤维组织。表明鹿茸多肽纳米复合材料因鹿茸多肽成分的引入在磷酸三钙的传导性基础上增加了骨诱导性能,提高了兔下颌骨缺损的修复效果。5. p38MAPK阻断剂SB203580使人成骨细胞增殖能力下降,20μM为阻断剂SB203580半数抑制浓度；ALP活性检测结果显示,阻断剂组ALP活性最低,复合材料组ALP活性最高,复合材料加阻断剂组ALP活性低于复合材料组；实时荧光定量PCR结果显示,阻断剂组ColⅠmRNA表达均低于对照组、复合材料组和复合材料加阻断剂组；与复合材料组比较,复合材料加阻断剂组ColⅠmRNA表达在干预初期二者相近,干预时间延长则复合材料加阻断剂组明显低于复合材料组,表明p38MAPK通路在人成骨细胞的分化成熟中起着重要的调控作用,鹿茸多肽纳米复合材料能够逆转阻断剂的作用,进一步促进细胞的ALP活性增高,ColⅠmRNA表达量增加。阻断p38MAPK通路并不能完全抑制复合材料促成骨细胞早期分化作用,提示鹿茸多肽纳米复合材料还可能通过其他信号通路调节成骨细胞的早期分化。本研究的创新之处,首次将天然活性多肽—鹿茸多肽复合到纳米磷酸三钙、明胶体系中,制备了具有生物活性的鹿茸多肽纳米复合材料。该项研究填补了鹿茸多肽在骨修复新型材料应用中的空白。首次证明了该新型复合材料对下颌骨缺损具有明显的修复作用。该项研究为临床骨缺损修复的新型材料的研究提供了理论和实验依据。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 英文缩略词表
• 第1章 绪论
• 1.1 立题依据及意义
• 1.2 研究内容
• 1.2.1 鹿茸多肽纳米复合材料的制备及性能研究
• 1.2.2 鹿茸多肽纳米复合材料的生物安全性评价
• 1.2.3 鹿茸多肽纳米复合材料对成骨细胞生物学特性的影响
• 1.2.4 鹿茸多肽纳米复合材料对兔下颌骨缺损修复影响的研究
• 1.2.5 鹿茸多肽纳米复合材料促成骨细胞早期分化机制的初步研究
• 1.3 文献综述
• 1.3.1 鹿茸多肽生物活性研究进展
• 1.3.2 骨缺损修复材料的研究进展
• 1.3.3 纳米磷酸钙复合材料的研究进展
• 1.3.4 MAPK信号传导通路在成骨细胞分化中的作用
• 第2章 鹿茸多肽纳米复合材料的制备及性能研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 试剂和仪器
• 2.1.2 实验方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 鹿茸多肽SDS-PAGE
• 2.2.2 SEM观察（二元复合微球）
• 2.2.3 XRD分析（二元复合微球）
• 2.2.4 R分析（二元复合微球）
• 2.2.5 SEM观察（三元复合微球）
• 2.2.6 SELDI-TOF-MS分析（三元复合微球）
• 2.3 讨论
• 第3章 鹿茸多肽纳米复合材料的生物相容性评价研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验方法
• 3.1.3 统计学处理
• 3.2 结果
• 3.2.1 细胞增殖检测
• 3.2.2 溶血实验
• 3.2.3 急性毒性实验
• 3.2.4 细胞毒性实验
• 3.2.5 人成骨细胞与鹿茸多肽复合材料粘附生长
• 3.3 讨论
• 第4章 鹿茸多肽纳米复合材料对成骨细胞生物学特性的影响
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 实验方法
• 4.1.3 统计学处理
• 4.2 结果
• 4.2.1 细胞增殖检测
• 4.2.2 碱性磷酸酶活性测定
• 4.2.3 茜素红染色检测矿化结节
• 4.2.4 鹿茸多肽纳米复合材料对损伤的人成骨细胞的影响
• 4.3 讨论
• 第5章 鹿茸多肽纳米复合材料对兔下颌骨缺损修复影响的研究
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 实验材料
• 5.1.2 实验方法
• 5.1.3 统计学处理
• 5.2 结果
• 5.2.1 表面观察
• 5.2.2 Micro-CT检查
• 5.2.3 组织学观察
• 5.2.4 扫描电镜观察
• 5.3 讨论
• 第6章 鹿茸多肽纳米复合材料促人成骨细胞早期分化机制的初步研究
• 6.1 材料和方法
• 6.1.1 实验材料
• 6.1.2 实验方法
• 6.1.3 统计学处理
• 6.2 结果
• 6.2.1 阻断剂SB203580对成骨细胞增殖的影响
• 6.2.2 nano TCP/gel/VAP对阻断剂SB203580作用下成骨细胞分泌ALP的影响
• 6.2.3 nano TCP/gel/VAP对阻断剂SB203580作用下成骨细胞Col Ⅰ mRNA表达的影响
• 6.3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 作者简介
• 攻读博士期间发表的论文
• 致谢