NPK1和NPR1基因的克隆及其转化辣椒的研究

论文摘要

辣椒（Capsicum annuum L.）是一种重要的蔬菜作物,具有丰富的营养价值和经济价值,世界各地广泛栽培。但由于恶劣的自然环境如低温、盐碱、高温、干早的影响以及病虫害的频繁发生,降低了辣椒的产量和品质。因此,提高辣椒的抗逆、抗病性已成为重要的研究课题。烟草NPK1基因是参与细胞周期调控的MAPKKK激酶在植物的生长发育调节和抗逆等生理过程中起重要作用,拟南芥NPR1基因是植物系统获得性抗性中的一个关键基因。本试验分别从拟南芥和烟草中克隆NPR1和NPK1基因,并构建了植物表达载体。以8个辣椒（Capsicum annuum L.）品种为材料,对辣椒高频再生体系的建立、影响农杆菌转化的诸因素、再生植株筛选与鉴定进行了较为系统的研究分析。并以辣椒子叶为外植体通过农杆菌介导的遗传转化方法将NPK1和NPR1基因导入辣椒获得转基因再生植株,同时用NPK1基因转化拟南芥。主要结果如下:1.辣椒植株离体再生体系中,较高的6-BA/IAA值有利于辣椒外植体的分化再生,而6-BA/IAA值较低则适合于再生芽的伸长;不同辣椒材料的再生能力差别较大,其中以B4、2096和B7的分化能力最强;辣椒带柄子叶再生能力比下胚轴强,是较好的外植体材料;不同苗龄的子叶再生能力也有差异,以12～16d苗龄的外植体分化频率较高;高频率的不定芽分化培养基为MB（MS无机成分+B5有机成分）+0.8mg/L IAA +5.0mg/L 6-BA +4.0mg/L AgNO3;不定芽伸长的适宜培养基为MB+ 0.8mg/L IAA + 2.0mg/L6-BA + 2.0mg/L GA3 + 4.0mg/L AgNO3;高效生根诱导培养基为MB+0.2mg/L IAA + 0.1mg/L NAA。2.农杆菌介导辣椒遗传转化的适宜条件是12d苗龄子叶外植体,在M1培养基（MB+0.8mg/L IAA+5.0mg/L 6-BA +4.0mg/L AgNO3）预培养2d后,浸没到农杆菌菌液中侵染8-12min,在M1培养基上共培养2d后转移至延迟培养基M2（MB+0.8mg/L IAA +5.0mg/L 6-BA +4.0mg/L AgNO3+250mg/L Cef）延迟选择2d。外植体转移至M3（MB+0.8mg/L IAA+5.0mg/L 6-BA+4.0mg/L AgNO3+250mg/L Cef+50mg/L Km）进行选择培养。3.试验共获得抗性植株65株,PCR检测阳性植株9株,其中转化NPK1基因阳性植株5株,转化NPR1基因阳性植株4株。4.对拟南芥转化NPK1植株进行抗旱分析表明:MDA的含量随着胁迫的加深而增加,抗逆性强的株系其体内MDA的含量较低;与MDA的变化趋势一样,随着胁迫的加深脯氨酸的含量增加,胁迫早期脯氨酸的含量与抗逆性成正相关。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章文献综述
• 1.1 辣椒基因工程研究进展
• 1.1.1 辣椒离体再生研究进展
• 1.1.2 辣椒遗传转化研究进展
• 1.1.2.1 抗病毒病
• 1.1.2.2 抗真菌病
• 1.1.2.3 抗细菌病
• 1.1.2.4 抗除草剂
• 1.1.2.5 抗虫基因工程
• 1.1.3 辣椒基因工程中存在的主要问题
• 1.1.3.1 辣椒植株再生
• 1.1.3.2 遗传转化率低
• 1.1.3.3 转化方法单一
• 1.2 植物抗病基因工程
• 1.2.1 基因对基因假说（gene-for-gene hypothesis）
• 1.2.2 系统性抗性
• 1.2.2.1 系统获得性抗性（systemic acquired resistance, SAR）
• 1.2.2.2 诱导性系统抗性（Inducing System Resistance, ISR）
• 1.2.2.3 植物抗病信号传导途径及其相互作用
• 1.2.2.4 NPR1 在植物抗病中的作用
• 1.3 植物抗旱基因工程研究
• 1.3.1 渗透保护物质（Osmoprotectant） 生物合成的关键酶基因
• 1.3.2 脯氨酸（ Proline） 生物合成的相关基因
• 1.3.3 糖类物质生物合成的相关基因
• 1.3.4 多元醇生物合成相关基因
• 1.3.5 多胺（Polyamine）
• 1.3.6 胚胎后期发生富集蛋白基因
• 1.3.7 编码转录因子的调节基因
• 1.3.8 抗氧化和毒性降解酶相关基因
• 1.3.9 MAPK 研究进展
• 1.4 研究的目的及意义
• 第二章材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株与质粒
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 培养基与溶液
• 2.2 方法
• 2.2.1 辣椒再生体系的建立
• 2.2.1.1 无菌苗的制备
• 2.2.1.2 不定芽的诱导和分化
• 2.2.1.3 不定芽的伸长
• 2.2.1.4 生根与移栽
• 2.2.2 烟草NPK1 基因及拟南芥NPR1 基因的克隆
• 2.2.2.1 拟南芥和烟草DNA 的提取
• 2.2.2.2 聚合酶链式反应
• 2.2.2.3 DNA 序列分析
• 2.2.3 载体构建
• 2.2.3.1 玻璃粉法回收DNA 片段
• 2.2.3.2 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
• 2.2.3.3 质粒DNA 的提取
• 2.2.3.4 冻融法将中间载体导入农杆菌
• 2.2.4 NPK1 基因和NPR1 基因导入辣椒
• 2.2.4.1 外植体Km 抗性测定
• 2.2.4.2 农杆菌转染
• 2.2.4.3 转化植株的再生
• 2.2.4.4 植株的PCR 检测
• 2.2.5 烟草NPK1 导入拟南芥
• 2.2.5.1 农杆菌介导的遗传转化（花序浸染法）
• 2.2.5.2 抗性植株的筛选和转基因植株的PCR 检测
• 2.2.5.3 转基因植株抗旱相关生理指标的测定
• 第三章 结果与分析
• 3.1 辣椒再生体系的建立
• 3.1.1 不定芽的诱导及分化
• 3.1.1.1 辣椒不同基因型对不定芽诱导分化的影响
• 3.1.1.2 不同激素及配比对辣椒不定芽诱导与分化的影响
• 3.1.1.3 不同外植体对不定芽诱导与分化的影响
• 3对不定芽诱导的影响'>3.1.1.4 AgNO₃对不定芽诱导的影响
• 3.1.2 不定芽的伸长
• 3.1.3 生根及移栽成苗
• 3.2 NPK1 和NPR1 基因的克隆及表达载体的构建
• 3.3 NPK1 基因和NPR1 基因转化辣椒
• 3.3.1 外植体Km 抗性测定
• 3.3.2 农杆菌的转染
• 3.3.3 转基因植株的PCR 检测
• 3.4 烟草NPK1 转化拟南芥
• 3.4.1 拟南芥转基因植株的检测
• 3.4.1.1 抗性植株筛选
• 3.4.1.2 抗性植株的PCR 检测
• 3.4.2 转基因植株抗旱性鉴定
• 3.4.2.1 干旱对丙二醛（MDA）含量的影响
• 3.4.2.2 干旱胁迫下脯氨酸含量的变化
• 第四章 讨论
• 4.1 辣椒再生体系的建立
• 4.1.1 激素和有机成分的使用
• 4.1.2 品种、外植体类型及苗龄的影响
• 3 的影响'>4.1.3 AgNO₃的影响
• 4.2 NPK1 和NPR1 基因的克隆及表达载体的构建
• 4.2.1 拟南芥NPR1 基因
• 4.2.2 烟草NPK1 基因
• 4.3 NPK1 基因和NPR1 基因转化辣椒
• 4.3.1 外植体Km 抗性测定
• 4.3.2 辣椒转NPK1 和NPR1 基因植株的获得
• 4.4 烟草NPK1 导入拟南芥
• 4.4.1 NPK1 基因转入拟南芥
• 4.4.2 转基因植株的抗旱性鉴定
• 4.5 存在问题及下一步工作
• 第五章 结论
• 参考文献
• 附录1
• 附录2
• 附录3
• 附录4
• 附录5
• 致谢
• 作者简历