人天然Fab段噬菌体抗体库的构建及抗gp96抗体的初步筛选

论文摘要

背景和目的 热休克蛋白gp96作为分子伴侣参与了肿瘤抗原向MHC-Ⅰ类分子途径的递呈过程,并与抗原肽形成gp96-肽复合物激活CD8+T淋巴细胞,产生抗肿瘤的特异性免疫反应。因此,gp96-肽复合物疫苗为肿瘤的免疫治疗提供了新的思路。但是,如此充满前景的疗法需要从有限的肿瘤组织中快速提取高纯度的gp96,传统的方法因为需要使用ConA-Sepharose柱,很容易造成ConA的污染,而ConA本身是一种T细胞丝裂原,可对疫苗接种者的免疫系统产生有害作用。所以,寻找一种快速有效而又高度特异性的方法分离纯化gp96,就成为该疫苗大规模临床应用所要解决的首要问题。噬菌体抗体库技术可有效地解决以上问题。我们利用噬菌体表面展示技术构建人天然Fab段噬菌体抗体库,建立人源抗体制备技术平台,为寻求恶性肿瘤的免疫治疗新方法打下基础。 方法 取4个健康献血员新鲜血液各200ml,分离淋巴细胞,提取总RNA,经逆转录合成cDNA,设计多对引物,以PCR扩增抗体轻链和重链Fd段cDNA。轻链PCR产物和噬粒载体pComb3经Sac Ⅰ和Xba Ⅰ酶切,由T4 DNA连接酶连接,电穿孔转化感受态大肠杆菌XL1-Blue,扩增后提取噬粒,构建轻链库。轻链库和重链Fd段PCR产物经Xho Ⅰ和Spe Ⅰ酶切,以同样方法连接后转化XL1-Blue,加入辅助噬菌体VCSM13,产生噬菌体抗体全库。提取噬粒酶切鉴定轻链库和全库有无插入片段。分别以噬菌体全库和提取的噬粒为模板,以轻、重链不同引物组合进行PCR扩增。构建的抗体库用人血白蛋白、IL-2和gp96等不同蛋白进行3轮筛选。 结果 提取的淋巴细胞总RNA及逆转录合成的cDNA质量好,部分重链Fd片段、部分κ轻链和λ轻链cDNA得到扩增。Fab全库库容达6.6×106,酶切和PCR显示有插入片段。用人血白蛋白、IL-2和gp96等不同蛋白进行几轮筛选,抗体库得到了不同程度的富集。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略语表
• 前言
• 材料与方法
• 一、材料
• （一） 试剂及用液
• （二） 主要仪器
• （三） PCR引物
• 二、方法
• （一） 外周血淋巴细胞的分离
• （二） 淋巴细胞总RNA的提取
• （三） 逆转录生成cDNA
• （四） 以cDNA为模板扩增β-actin以验证cDNA质量
• （五） RT-PCR扩增轻链和重链基因片段及纯化回收
• （六） 噬粒pComb3的扩增和感受态大肠杆菌XL1-Blue的制备
• （七） 轻链库的构建及鉴定
• （八） 辅助噬菌体VCSM13的扩增和滴度测定
• （九） 噬菌体Fab抗体库的构建和鉴定
• （十） gp96特异性抗体的富集与淘选
• 结果
• 一、提取外周血淋巴细胞总RNA
• 二、以淋巴细胞总RNA为模板逆转录生成cDNA及鉴定
• 三、PCR扩增重链Fd段和轻链基因
• 四、噬粒pComb3的扩增
• 五、双酶切pComb3和轻链PCR产物
• 六、轻链库的构建及鉴定
• 七、噬菌体Fab抗体库的构建和鉴定
• 八、gp96特异性抗体的富集与淘选
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 综述
• 致谢
• 附录：在读期间发表的文章和参编的著作
• 论著