光敏核不育水稻农垦58S的转录组和蛋白质组研究

论文摘要

自1973年光敏核不育水稻农垦58S被发现,研究者们定位了三个光敏核不育基因（Photoperiod-sensitive Male Sterile, pms）:pms1、pms2和pms3,它们分别位于7号、3号和12号染色体上,由于表型鉴定的复杂性,并没能成功克隆到光敏核不育基因,研究者们仅在光敏核不育水稻生理生化以及细胞学方面进行了系统研究,至今还没有对光敏核不育水稻育性转换期的转录组和蛋白质组研究的报道。为了研究长日照导致光敏核不育水稻农垦58S雄性不育的分子机理,我们利用水稻表达谱芯片比较分析了农垦58S在长、短日照下的转录组差异；同时我们利用同重标签相对绝对定量方法（isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation,iTRAQ）对农垦58S和农垦58N在长日照下的蛋白质组进行了分析。主要结果如下：A、通过对农垦58S在长、短日照条件下的育性发育敏感时期的叶片进行转录组分析,结果发现：在颖花原基分化期长、短日照之间的差异基因共有73个,被长日照抑制倍数变化大于5倍的基因有5个,被短日照激活倍数变化大于5倍的基因只有1个；在雌雄蕊原基分化期长、短日照之间总的差异基因数量增加至128个,被长日照抑制倍数变化大于5倍的基因有22个,被短日照激活倍数变化大于5倍的基因仅有5个。这些结果表明长日照抑制了农垦58S在第二光周期下的基因表达。随着幼穗发育进程的推进差异基因的数目在增加,这表明不育的发生具有累积效应,这与长日照在光敏时期的育性影响具有累积效应一致。B、为了在众多差异基因中寻找到受光周期调控的代谢通路,我们对这些差异基因进行了GO注释和pathway分析,我们发现这些差异基因与生物节律途径和开花途径有关。其中生物节律途径中的RICE PSEUDORESPONSE REGULATOR1（OsPRR1）、RICE PSEUDORESPONSE REGULATOR37（OsPRR37）、RICE GIGANTEA（OsGI）和RICE LATE ELONGATED HYPOCOTYL （OsLHY）4个基因可能参与了光敏核不育的育性转换过程；水稻开花途径中的EARLY HEADING DATE1（Ehd1）, HEADING DATE3a（Hd3a）, RICEFLOWERING LOCUS T1（RFT1）,OsMADS BOX1（OsMADS1）4个基因可能参与了光敏核不育的育性转换过程途径。C、通过对参与水稻生物节律和开花基因以及芯片中的差异基因在长、短日照下农垦58S和农垦58N之间在四个发育时期的昼夜表达模式的分析,发现参与水稻生物节律的基因OsPRR1、OsPRR37、OsGI和OsLHY在第二光周期中在农垦58S和农垦58N之间有显著地节律性差异,这暗示了光敏核不育水稻的育性转换过程是水稻生物节律的output pathway。D、我们发现参与水稻开花通路的Ehd2、Ehd1、Hd3a、RFT1和OsMADS1等基因长日照条件下虽在农垦58S中受到抑制,但在农垦58S和农垦58N之间没有节律性差异。Hdl是开花通路基因中唯一没有被长日照抑制的基因,它在第二光周期中在农垦58S和农垦58N之间表现有显著地节律性差异,这暗示了Hdl也参与了光敏核不育水稻的育性转换过程,并且在该过程中存在OsGI对Hdl的调节。E、通过在对24个差异基因进行生物节律分析后发现：转录因子OsDof在第二光周期中在农垦58S和农垦58N之间有显著地节律性差异,并且表现出与OsLHY相似的表达模式。这表明OsDof可能参与了光敏核不育水稻的育性转换过程,推测可能位于OsLHY的下游。F、水稻光敏色素和隐花色素在农垦58S和农垦58N之间不表现出节律性的差异。这暗示了光敏色素和隐花色素可能体现在蛋白质水平。G、为了了解HYA、PHYB和CRY1b在农垦58S和农垦58N的幼穗中是否存在组织特异性的差异,我们利用组织原位杂交技术分析了它们表达的组织特异性。结果显示PHYA、PHYB和CRY1b在不同的光照条件下在农垦58S和农垦58N的幼穗中没有组织特异性的差异,均集中在幼穗的顶端分生组织中表达。H、利用iTRAQ方法对农垦58S和农垦58N在第二光周期的长日照下叶片的蛋白质组进行了分析,我们发现在颖花原基分化期共有75个差异蛋白,到雌雄蕊原基形成期差异蛋白数量增加至102个。差异蛋白的总数随着幼穗发育进程向前推进和长日照处理的时间的延长而增加,这表明在蛋白水平上的差异表现出积累效应,在颖花原基分化期农垦58S中有33个蛋白的表达量比农垦58N高,到雌雄蕊原基形成期则有62个蛋白的表达量比农垦58N高,增加了大约一倍,而比农垦58N表达量低的蛋白数量则从42个减少为40个,这就暗示了随着幼穗发育进程向前推进和长日照处理的延长,不育发生过程存在积累效应。这些结果与转录组得到的结果一致。Ⅰ、蛋白组学结果发现,与光合作用相关的蛋白质在农垦58S中受到影响。对差异基因进行分析后发现在颖花原基分化期,在农垦58S中共有13个光合作用相关蛋白的表达量要低于农垦58N；在雌雄蕊原基形成期里则有13个光合作用相关蛋白的在农垦58S中表达要高于农垦58N。这一结果表明农垦58S中光合作用相关蛋白表达异常,暗示了其中叶绿体的功能发生异常变化,与前人的农垦58S的叶绿体的结构异常的研究结果一致。J、结果发现与翻译相关的蛋白质在农垦58S中被抑制。在颖花原基分化期,共有6个翻译相关蛋白被抑制；在雌雄蕊原基形成期则有11个被抑制。这一结果表明在育性转化期内农垦58S中蛋白质的翻译受到阻碍。通过以上结果,我们提出了一个光敏核不育水稻育性调控机制的模型：在长日照条件下,农垦58S的育性转换同时受生物节律和开花两条通路的调节,在生物节律通路中,参与生物节律的基因将长日照的信号传递至下游OsDof基因,再通过一系列的信号传递,最终作用于那些影响花粉发育的基因,从而导致雄性不育；在开花控制通路中,长日照信号通过未知的因子激活OsGI基因表达,然后通过对Hdl来调节,与生物节律基因共同参与花粉的发育,从而导致花粉不育,导致雄性不育。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 第一章 文献综述
• 1. 光调控研究进展
• 1.1 动物光调控研究进展
• 1.1.1 动物光受体
• 1.1.2 动物光信号传导
• 1.2 植物光受体
• 1.2.1 植物光敏色素
• 1.2.2 植物隐花色素
• 1.2.3 植物向光素
• 1.3 植物的光调控
• 2. 生物节律（CIRCADIAN RHYTHM）研究进展
• 2.1 动物生物节律的研究进展
• 2.2 植物生物节律进展
• 2.2.1 植物生物节律研究历史
• 2.2.2 植物生物节律的相关基因及其调控模型
• 2.2.3 植物生物节律与其他信号通路的相互作用
• 3. 植物的开花
• 3.1 拟南芥开花调控
• 3.1.1 拟南芥光周期与开花调控
• 3.1.2 拟南芥春化与开花
• 3.2 水稻的开花基因以及开花调控
• 4. 光周期敏感雄性不育水稻研究进展
• 4.1 水稻雄性不育
• 4.1.1 植物雄性不育的现象与研究意义
• 4.1.2 植物雄性不育的表型特征和细胞学特征
• 4.1.3 植物雄性不育的遗传学特性
• 4.1.4 水稻细胞质雄性不育
• 4.2 水稻光周期敏感雄性不育
• 4.2.1 水稻光周期敏感雄性不育的发现与意义
• 4.2.2 光周期敏感雄性不育水稻的基本特性
• 4.2.3 光周期敏感水稻雄性不育基因的遗传学研究进展
• 4.2.4 光周期敏感雄性不育水稻激素水平变化的研究
• 4.2.5 光周期敏感雄性不育水稻表达水平的研究
• 4.2.6 光周期敏感雄性不育水稻细胞学以及生理生化研究进展
• 第二章 光周期敏感雄性不育水稻农垦58S转录组研究
• 1. 前言
• 2. 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 供试水稻品种
• 2.1.2 材料的种植方式及光照处理
• 2.1.3 取材时间与部位
• 2.2 方法
• 2.2.1 试剂
• 2.2.2 水稻表达谱芯片分析
• 2.2.3 水稻叶片总RNA提取及实时定量PCR
• 2.2.4 水稻幼穗的组织原位杂交
• 2.2.5 引物
• 3. 结果与分析
• 3.1 长日照抑制第二光周期下农垦58S叶片中的基因转录
• 3.2 对长、短日照差异表达基因的GO注释和PATHWAY分析
• 3.2.1 GO分子功能注释分析
• 3.2.2 Pathway分析的结果
• 3.3 利用定量PCR技术分析差异基因昼夜节律
• 3.3.1 生物节律参与光敏核不育的败育过程
• 3.3.2 水稻开花调控途径参与光敏核不育
• 3.3.3 光敏色素和隐花色素作为输入信号起始雄性不育的转化
• 3.4 PHYA、PHYB和CRY1B幼穗组织原位杂交结果
• 4. 讨论
• 4.1 光敏核不育调控的模型
• 4.2 光敏核不育信号通路与开花途径的相似之处
• 第三章 光周期敏感雄性不育水稻农垦58S的蛋白质组学研究
• 1. 前言
• 1.1 蛋白质组学技术的发展
• 1.2 ITRAQ技术
• 1.2.1 iTRAQ技术基本原理
• 1.2.2 iTRAQ技术的优点和缺点
• 1.2.3 iTRAQ技术在植物研究中的运用
• 1.3 光敏核不育水稻农垦58S蛋白质组学研究进展
• 1.4 本研究的目的和意义
• 2. 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.2.1 总蛋白提取
• 2.2.2 总蛋白的预处理与定量
• 2.2.3 总蛋白的标记
• 2.2.4 iTRAQ分析流程
• 2.2.5 iTRAQ实验结果的生物信息学分析
• 3. 实验结果与分析
• 3.1 农垦58S与农垦58N在不同发育阶段的蛋白质差异
• 3.2 光合作用相关基因在农垦58S中受到长日照的影响
• 3.3 长日照下在两个不同的发育时期里,农垦58S中与翻译有关的蛋白被下调
• 4. 讨论
• 4.1 光合作用相关蛋白与核糖体蛋白的相关性
• 4.2 蛋白组学结果与芯片结果的相关性
• 4.3 光合作用和核糖体蛋白调控在光敏核不育形成中的可能机制
• 4.4 ITRAQ实验的不足之处
• 附录
• 参考文献
• 致谢