SIGIRR在急性肺损伤中的作用及其相互作用蛋白的筛选与初步研究

论文摘要

1.背景与目的急性肺损伤（acute lung injury, ALI）/急性呼吸窘迫综合症（acute respiratory distress syndrome, ARDS）是由炎症失控而引起的临床危急重症,目前尚缺乏有效的特异性治疗。Toll样受体（Toll like receptors, TLRs）是固有免疫系统中的主要病原模式受体之一,TLR信号通路的过度激活是导致炎症反应爆发失控的重要机制。单免疫球蛋白白介素-1受体相关蛋白（single immunoglobin IL-1 receptor related protein, SIGIRR）是新近发现的Toll样受体/白介素-1受体（Toll like receptor/Interleukin-1 receptor, TIR）超家族成员,又称为TLR-IL-1R8 （TIR8）,是TLR信号通路中的负性调控分子。但目前有关SIGIRR在急性肺损伤中的确切作用尚未见报道。SIGIRR的负性调控机制可能与其“俘获”TLR-IL-1R （TIR）信号通路中的关键组分而抑制TIR信号的转导有关,但具体的分子机制仍有待进一步阐明。SIGIRR的胞内段TIR域是其发挥功能的重要结构,目前已证实,SIGIRR能通过胞内段TIR域与TIR信号通路中IL-1R或TLR4受体复合物发生相互作用。酵母双杂交系统是研究蛋白质间相互作用的高效的新技术,通过以已知功能的蛋白质基因筛选双杂交cDNA文库,可发现与已知蛋白分子有相互作用的新分子并推测新分子可能的功能。鉴于此,本课题拟通过构建腺病毒表达载体上调SIGIRR在肺内的表达,在内毒素急性肺损伤小鼠模型中确定SIGIRR的作用;通过酵母双杂交系统,在人肺cDNA文库中筛选与SIGIRR有相互作用的蛋白并对有意义的阳性克隆进行初步研究;以期阐明SIGIRR在ALI中的确切作用及SIGIRR负性调控TIR信号的机制,并为ALI/ARDS的防治提供新的作用靶点。2.方法（1）重组SIGIRR基因腺病毒表达载体的构建与鉴定以pCMV-SPORT6-mSIGIRR为模板保真扩增小鼠源性murine SIGIRR （mSIGIRR）基因,经过酶切和连接反应构建重组质粒pDC316-mSIGIRR,并行酶切和测序鉴定;采用AdMaxTM包装系统,将穿梭质粒pDC316-mSIGIRR和骨架质粒pBHGloxE1,3Cre共转入包装293细胞中,构建携带mSIGIRR基因的重组腺病毒载体Ad.mSIGIRR;通过PCR扩增、病毒颗粒吸光度值测定及TCID50的方法,对重组腺病毒Ad.mSIGIRR的质量和滴度进行鉴定;建立Ad.mSIGIRR体内外的感染模型,利用Western blot、免疫组化和肺组织切片HE染色的方法,对Ad.mSIGIRR在真核细胞与肺内的表达效力及对宿主肺部病理改变的影响进行检测。（2） SIGIRR过表达对小鼠内毒素性急性肺损伤的保护作用用经鼻滴注的方法,以4×107 PFU/只的剂量建立小鼠重组腺病毒Ad.mSIGIRR感染模型,同时用空病毒载体Ad.V作为对照。感染48 h后,以LPS （15 mg/kg）腹腔注射复制内毒素性急性肺损伤模型。在LPS刺激后的各个时间节点,用RT-PCR、Western blot和免疫组化的方法比较Ad.mSIGIRR组和Ad.V组之间SIGIRR的表达情况;同时对比两组间的肺组织病理改变、肺损伤评分情况以及模型小鼠的7天存活率的变化;用ELISA法和硝酸还原酶法分别检测两组肺内和血清中TNF-α及肺内NO含量变化;用邻连茴香胺-比色法检测两组肺内MPO活性变化;用EMSA和ELISA两种方法比较两组间肺内核转录因子NFκB的活性。（3） SIGIRR相互作用蛋白的筛选与初步研究以pReceiver-LV19-SIGIRR质粒为模板保真扩增获得人SIGIRR胞内区（480-1230 bp）基因片段,经过酶切和连接反应构建重组诱饵质粒pSos-SIGIRR,并行酶切和测序鉴定;按照stratagene公司CytoTrap yeast two-hybrid体系的说明行温度敏感型酵母菌的表型与回复突变鉴定以及诱饵质粒自激活检测后,将诱饵质粒pSos-SIGIRR与人肺cDNA文库质粒,共转化感受态酵母细胞筛选鉴定与SIGIRR胞内区相互作用的蛋白,免疫共沉淀的方法进一步验证筛选结果;应用生物信息学的方法,分析比对阳性克隆序列,同时查阅相关文献选取有意义的阳性克隆为对象进行后继研究;用RT-PCR的方法检测paralemmin-3在人肺泡上皮细胞系（A549细胞）中有无表达;用Realtime-PCR的方法比较A549细胞中,LPS刺激后SIGIRR和paralemmin-3的表达变化;用RNA干扰的方法下调A549细胞中paralemmin-3的表达,观察paralemmin-3对LPS诱导的A549细胞炎症因子释放的影响。3.结果（1）成功构建了携带小鼠源性SIGIRR基因的重组腺病毒表达载体Ad.mSIGIRR,病毒颗粒数和感染滴度分别为:4.65×1011 VP/ mL和4×109 PFU/mL,符合实验要求;Western blot和免疫组化的方法分别检测到mSIGIRR在体内外的高效表达,且经鼻滴注感染宿主后,不会引起宿主肺组织发生病理变化。（2） SIGIRR组成性表达于正常小鼠肺组织,主要分布于肺上皮细胞。LPS腹腔注射后,小鼠肺内SIGIRR的表达下调,但与正常小鼠及Ad.V对照组相比,Ad.mSIGIRR组小鼠肺内SIGIRR表达显著增加（P < 0.05）;与Ad.V对照组相比,Ad.mSIGIRR组小鼠肺组织的病变减轻、炎症介质TNF-α和NO含量减少、肺内MPO和NFκB活性降低、肺损伤小鼠7天存活率显著提高（P < 0.05）。（3）通过酵母双杂交实验,共筛选到4个与SIGIRR胞内区之间存在可能相互作用的阳性克隆,分别是:Homo sapiens mitochondrion, complete genome;Homo sapiens cyclin H （CCNH）, mRNA;Homo sapiens paralemmin-3 （PALM3）, mRNA;Homo sapiens v-ki-ras2 kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog （KRAS）, mRNA;其中Homo sapiens mitochondrion, complete genome为非编码序列,KRAS为Cytotrap酵母双杂交系统中的背景性假阳性蛋白,CCNH为细胞周期素H定位于细胞核,与SIGIRR缺少共同物理空间定位。而PALM3为paralemmin蛋白家族成员,定位于细胞膜,与SIGIRR有共同物理空间定位,因此选择PALM3作为后继研究的对象;免疫共沉淀结果进一步验证了PALM3与SIGIRR间的相互作用;RT-PCR检测证实PALM3在A549细胞中有表达,LPS刺激后,SIGIRR的表达下调而PALM3的表达上调;沉默PALM3的表达,减少LPS诱导的A549细胞炎性细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β的释放（P < 0.05）。4.结论（1） LPS刺激后,小鼠肺内SIGIRR的表达下调,增强小鼠肺内SIGIRR的表达能通过负性调控LPS-TLR4信号的转导而对内毒素性急性肺损伤起保护作用;（2）通过酵母双杂交及免疫共沉淀实验,我们证实PALM3是SIGIRR新的相互作用分子,LPS刺激上调A549细胞中PALM3的表达,SIGIRR与PALM3之间的相互作用可能是SIGIRR负性调控TLRs信号通路的机制之一。

论文目录

• 英文缩写一览表
• 英文摘要
• 中文摘要
• 前言
• 第一部分 重组SIGIRR基因腺病毒表达载体的构建与鉴定
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第二部分 SIGIRR过表达对小鼠内毒素性急性肺损伤的保护作用
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第三部分 SIGIRR相互作用蛋白的筛选与初步研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 全文结论
• 致谢
• 参考文献
• 文献综述
• 参考文献
• 在读期间发表论文情况