利用水稻悬浮细胞检测水稻白叶枯病菌突变菌株的致病性研究

论文摘要

水稻抗白叶枯病基因Xa23是从我国普通野生稻（Oryza rufipogon）中鉴定出来的优良基因,对国内外鉴别菌系表现为高抗、完全显性和全生育期抗病。目前未发现能克服Xa23基因抗性的白叶枯病天然菌株。利用Tn5转座系统构建了Xa23鉴别菌株P6的突变体库,约2.4万个突变菌株,期望从中检测出能使携带Xa23基因的水稻材料感病的白叶枯菌株。目前鉴定白叶枯菌致病菌株的方法主要采用水稻植株剪叶接种法和注射接种法,这两种方法工作量大,且往往受水稻生长季节等条件的制约。在实验室条件下,研究利用水稻悬浮细胞系检测P6突变体致病性实验系统,为在细胞水平筛选和研究其它病原菌提供新的思路。研究结果如下:1、以水稻中野1号的成熟胚为外植体,在pH值为5.8的N6诱导培养基上诱导愈伤组织,25℃黑暗条件下继代培养3个月后,可以得到大量胚性愈伤组织。选择淡黄色、质地疏松的胚性愈伤组织为悬浮培养的细胞来源,并在pH值为5.6的N6液体继代培养基中,26℃,110-130rpm,暗光条件下进行悬浮培养,再经过4-6次继代,可获得理想悬浮细胞系。2、亲和菌株XMS-25、XMS-30诱导的水稻细胞死亡率低,在1-78h内与未经处理的对照无明显差异,表明亲和性菌株不能诱导水稻悬浮细胞过敏性反应（Hypersensitive reaction,HR）。在非亲和菌株P6和悬浮细胞非亲和性互作中,48h前互作体系的死亡率和抽提液的颜色变化均不明显;48-60h之间,悬浮细胞死亡率逐渐增加,抽提液的颜色也逐渐加深;60h后,细胞死亡率增至最大,细胞死亡率和抽提液的颜色的变化均趋于稳定。这说明悬浮细胞在48h后开始大量死亡,也说明非亲和菌株能诱导水稻悬浮细胞产生HR。本研究建立了携带Xa23基因的水稻品种中野1号的悬浮细胞系,系统研究了悬浮细胞与白叶枯菌P6及其突变体致病菌株的互作,发现中野1号悬浮细胞与致病菌株互作中存在强烈的HR,溴酚蓝染色细胞抽提液的颜色和OD595值可以作为检测致病菌株与非致病菌株的指标,建立了利用水稻悬浮细胞系检测P6突变体致病性的实验系统。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 概述
• 1.2 植物组织培养研究进展
• 1.2.1 植物组织培养的基本概念
• 1.2.2 植物组织培养的应用现状
• 1.2.2.1 脱毒及快速繁殖
• 1.2.2.2 在遗传育种方面的应用
• 1.2.2.3 在次生代谢物方面的应用
• 1.2.2.4 在植物种质资源保存和交换上的应用
• 1.2.2.5 在遗传、生理、生化和病理研究上的应用
• 1.2.3 水稻悬浮培养技术
• 1.3 水稻抗白叶枯病研究进展
• 1.3.1 水稻白叶枯病的概况
• 1.3.2 水稻抗白叶枯病基因研究
• 1.3.3 植物病原细菌的无毒基因研究进展
• 1.3.4 抗病基因和无毒基因的互作研究
• 1.3.4.1 植物和病原菌互作
• 1.3.4.2 抗病基因和无毒基因的互作
• 1.4 诱导植物HR细胞死亡的信号分子
• 1.4.1 钙离子
• 1.4.2 一氧化氮（nitrieoxide,NO）
• 1.4.3 水杨酸（salicylic acid,SA）
• 1.4.4 活性氧（reactive oxygen species,ROS）
• 1.5 研究目的与意义
• 2.材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 培养基配制
• 2.3 悬浮细胞系的制备方法
• 2.3.1 诱导水稻愈伤组织
• 2.3.1.1 种子消毒
• 2.3.1.2 愈伤组织的诱导
• 2.3.2 悬浮细胞系的建立
• 2.3.2.1 细胞的悬浮培养
• 2.3.2.2 细胞悬浮培养的继代方法
• 2.3.2.3 悬浮细胞系的获得
• 2.4 白叶枯病菌的培养和保存
• 2.5 悬浮细胞和白叶枯菌的共培养
• 2.6 溴酚蓝染色分析细胞死亡率
• 2.7 植株抗病接种鉴定
• 2.8 NO（nitric oxide）含量的测定
• 3 结果与分析
• 3.1 水稻种子诱导生长情况
• 3.2 水稻品种间的诱导率及发芽率
• 3.2.1 JG30的诱导率及发芽率
• 3.2.2 CBB23的诱导率及发芽率
• 3.2.3 牡丹江8号的诱导率及发芽率
• 3.2.4 中野1号的诱导率及发芽率
• 3.2.5 品种间的诱导率及发芽率比较
• 3.3 ABA梯度试验结果
• 3.4 水稻品种间愈伤组织的褐化情况
• 3.5 愈伤组织的继代
• 3.6 悬浮细胞系的建立
• 3.7 悬浮细胞的再生
• 3.8 白叶枯病菌的培养与复壮
• 3.9 水稻悬浮细胞与白叶病菌互作引起HR
• 3.10 NO参与水稻悬浮细胞启动HR
• 4 讨论与结论
• 4.1 影响水稻胚性愈伤组织诱导的因素
• 4.1.1 培养基的影响
• 4.1.2 植物生长调节剂的影响
• 4.1.3 外界条件的影响
• 4.1.3.1 光照条件
• 4.1.3.2 温度条件
• 4.2 影响细胞悬浮培养的因素
• 4.2.1 液体培养基pH值的影响
• 4.2.2 外界条件的影响
• 4.3 悬浮细胞系获得
• 4.4 白叶枯病原菌的毒力差异
• 4.5 鉴定白叶枯病原菌致病菌株的方法
• 4.6 病原菌-植物悬浮细胞系检测系统
• 4.7 NO在植物抗病反应中作用
• 4.8 本文小结
• 致谢
• 参考文献
• 附录