论文摘要
目的:晚期糖基化终末产物（AGEs）引起体内一系列病理生理改变,是导致糖尿病慢性并发症的主要致病因素。近来有研究指出骨蛋白也受糖基化修饰的影响。骨组织中AGEs的产生和积聚可能是骨组织结构恶化以及骨细胞分化增殖障碍的一个原因。AGEs通过与其受体RAGE或AGEs结合蛋白相互作用,干扰骨重建过程,导致糖尿病骨代谢紊乱的发生发展。RAGE作为AGEs的主要信号转导受体,属于细胞表面分子免疫球蛋白超家族成员。许多研究显示RAGE参与了包括糖尿病骨质疏松在内的糖尿病慢性并发症的发生与发展过程,而其多配体的特性,可能使其具有与其他AGEs受体不同的作用机制。但RAGE在糖尿病骨组织内的表达水平如何,目前有关研究甚少。本研究主要目的是利用长期高糖高脂饮食联合小剂量链脲佐菌素,制备2型糖尿病大鼠模型,结合离体骨密度（BMD）、骨组织形态计量学和生物力学试验等指标,并测定骨转换血清生化标志物,研究2型糖尿病大鼠骨代谢的特点及骨组织RAGE的表达。方法:3月龄健康Wistar大鼠60只,雌雄各半,实验前大鼠适应性喂养1周,雄雌分别按体重编号,各随机取出每组6只作正常对照组（A为雄性正常组,C为雌性正常组）,喂以普通饲料。余48只大鼠作糖尿病造模组（B为雄性糖尿病组,D为雌性糖尿病组）,高糖高脂饲料喂养8周（不限每日热量）,禁食12h后一次性左下腹腔注射STZ（30mg/kg）,而D组在第一次STZ注射后3周,又追加一次STZ,A、C组注射等量柠檬酸盐缓冲液对照。B组在STZ注射后连续3周,D组在首次STZ注射后连续5周,每周固定时间大鼠尾静脉采血测血糖,做腹腔内葡萄糖耐量（Intraperitoneal glucose tolerance test,IPGTT）。方法为:大鼠禁食6～8h,按2g/kg体重腹腔注射30%葡萄糖溶液,尾静脉采血测定0、30、60、120min血糖,以空腹血糖（FPG）≥7.0 mmol/L,或糖负荷后2h血糖≥l1.1mmol/L者为糖尿病造模成功鼠。造模期间每周均做IPGTT,造模成功鼠继续高脂饲料喂养。成模后所有大鼠每周固定时间测血糖和体重,持续观察20周。对于血糖值≥30mmol/L者,皮下注射小剂量长效胰岛素（0.4U/100g体重）作为基础胰岛素量以维持生命,但不明显影响血糖水平。成模20周后对大鼠体重（BW）、空腹血糖（FBG）、胰岛素水平（INS）进行检测,并计算胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）、胰岛素敏感性指数（IAI）。颈动脉取血处死所有大鼠,测定血清Ca、P、骨钙素（BGP）、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）、胰岛素样生长因子-1（IGF-1）水平以及抗凝血糖化血红蛋白A1c（HbA1c）、尿Ca、肌酐、羟脯氨酸水平。留取腰椎、股骨、胫骨等骨标本,用DEXA法测定腰椎（L1-L6）及股骨BMD,用万能材料分析仪行腰椎（L5）压缩试验及股骨三点弯曲试验,取右侧胫骨上端制备不脱钙骨切片做骨组织形态计量学分析。同时用免疫组化方法检测RAGE在正常和2型糖尿病大鼠不脱钙骨组织切片上的表达。采用MCID Analysis Evaluation 7.0图像分析软件,对染色强度进行定量分析。每例切片随机选取5个视野,光镜400倍下将图像捕入图像分析软件系统,计算阳性细胞的平均光密度值和阳性细胞率。提取大鼠股骨总RNA,利用RT-PCR方法检测大鼠股骨RAGE基因表达。用荧光分光光度计在340nm波长激发光和456nm发射光下,考马斯亮蓝法测定稀释液的蛋白质浓度,以此血清AGEs含量间接反映骨组织AGEs含量。所有数据均以均数±标准差（x±SD）表示,采用SPSS13.0统计软件进行分析。计量样本均数组间的比较用独立样本t检验。并分别对2型糖尿病大鼠骨组织上RAGE与BMD、骨生物力学、骨组织形态计量学指标及TRAP、HbA1C、IGF-1、BGP等血清生化标志物进行相关性分析,P﹤0.05有统计学意义。结果:1、体重与血糖的变化:与普通饲料喂养的正常对照组大鼠比较,雄性糖尿病组大鼠高脂饮食8周后体重增加了13.42%,雌性增加了8.29%,差异有显著性（P<0.05或P<0.01）,注射STZ后体重渐下降,最终在一定范围内稳定;单纯高脂饮食8周,两组大鼠血糖没有显著性差异,注射STZ后雄性糖尿病组大鼠血糖为11.99±3.17 mmol/L、4.70±0.55 mmol/L,雌性糖尿病组15.17±3.07 mmol/L、4.60±0.36 mmol/L,显著升高（P<0.01）。雄性糖尿病组大鼠较正常对照组血清AGEs、FPG、FINS及HOMA-IR分别增加了95.02%、60.34%、49.59%、161.38%,雌性分别增加了93.18%、63.76%、42.65%、138.28%,差异有显著性（P<0.01）。2、BMD与骨生物力学特性:与各自正常对照组大鼠比较,雄性糖尿病组骨灰干重比降低了8.45%,腰椎L5BMD减少了21.33%,股骨BMD减少了15.60%,腰椎最大载荷减少了34.02%,股骨弹性模量减少了33.16%,最大弯曲应力减少了20.19%,差异有显著性（P<0.05）;雌性糖尿病组骨灰干重比减少了6.14%,腰椎L5BMD减少了14.07%,股骨BMD减少了16.02%,腰椎最大载荷减少了26.69%,股骨弹性模量减少了23.59%,最大弯曲应力减少了11.78%,差异有显著性（P<0.05或P<0.01）,证明2型糖尿病大鼠存在骨量减少。3、骨组织形态计量学:雄性糖尿病组大鼠骨小梁相对体积、骨小梁厚度、骨小梁数量、骨矿化沉积率、骨形成率分别降低了37.55%、14.74%、17.89%、24.49%、80.77%,雌性降低了29.19%、19.17%、25.79%、31.91%、81.33%,均有显著性差异（P<0.01）;而雄性骨小梁分离度、破骨表面增加了33.28%、76.55%,雌性增加了35.99%、76.67%,差异有显著性（P<0.01）。4、血清生化指标细胞因子的水平:与各自正常对照组相比,雄性糖尿病组血清TRAP、TG、TC、HbA1c分别增加了107.33%、124.66%、14.84%、89.52%,雌性糖尿病组增加了83.68%、46.15%、25.35%、61.84%,均有显著性（P<0.05或P<0.01）;雄性血清BGP、IGF-Ⅰ分别降低了22.49%、20.92%,雌性降低了23.95%、18.02%,有显著性（P<0.05或P<0.01）。5、RAGE的定量表达:1)定量分析:与各自正常对照组比较,糖尿病组大鼠RAGE阳性细胞率分别为雄性1.14±0.35、0.18±0.09,雌性0.75±0.17、0.10±0.04,阳性细胞平均光密度值分别为雄性0.0072±0.0024、0.0016±0.0003 ,雌性0.0054±0.0012、0.0013±0.0002,雄性、雌性糖尿病组RAGE表达均升高（P<0.01）。2)大鼠骨组织RAGE的RT-PCR分析:雄性、雌性糖尿病组大鼠骨组织检测到RAGE的表达,而正常组未检测到RAGE的表达。6、相关分析:雄性、雌性糖尿病组血清RAGE与灰干重比、股骨弹性模量、骨小梁相对体积、骨小梁数量、骨小梁厚度、骨矿化沉积率、骨形成率、BGP、IGF-Ⅰ成显著负相关（雄性r=-0.672,P<0.01; r=-0.667,P<0.01; r=-0.876,P<0.001;r=-0.630,P<0.01;r=-0.672,P<0.01;r=-0.733,P=0.001;r=-0.861,P<0.001;r=-0.659,P<0.01;r=-0.547,P<0.05;雌性r=-0.594,P<0.05;r=-0.478,P<0.05;r=-0.881,P<0.001;r=-0.701,P=0.001;r=-0.839,P<0.001;r=-0.861,P<0.001;r=-0.869,P<0.001;r=-0.710,P=0.001;r=-0.722,P=0.001）,而RAGE与FPG、HbA1c、骨小梁分离度、单位骨小梁面积上破骨细胞数成显著正相关（雄性r=0.595,P<0.05;r=0.669,P<0.01;r=0.660,P<0.01;r=0.860,P<0.001;雌性r=0.759,P<0.001;r=0.783,P<0.001;r=0.703,P=0.001;r=0.868,P<0.001）。结论:1、该造模方法可以成功建立2型糖尿病大鼠模型,该模型大鼠具有高血糖、脂质代谢紊乱和胰岛素抵抗特点,与人类2型糖尿病代谢特征相似,是研究人类2型糖尿病较理想的动物模型。2、糖尿病动物造模成功率及稳定性与性别有关,雄性大鼠较雌性大鼠成模率高,稳定性好,且耗时更短。3、雌性、雄性糖尿病大鼠BMD、骨生物力学指标、骨组织形态计量学反映成骨活性的参数均降低,而形态计量学反映破骨活性的参数升高,表明此糖尿病大鼠模型存在骨质疏松现象。4、雌性、雄性糖尿病大鼠骨组织RAGE含量、血清AGEs含量显著增高,并且RAGE与BMD、力学指标、形态计量学反映成骨活性的参数有显著负相关,RT-PCR检测到糖尿病组大鼠骨组织RAGE的表达,说明RAGE参与糖尿病骨代谢紊乱的发生发展。
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