番木瓜叶肉原生质体分离以及GFP瞬时表达研究

论文摘要

番木瓜（Carica papaya L.）是热带及亚热带国家重要的经济果树,因其营养价值高,在医药和化工上有着广泛应用。2008年番木瓜基因组测序也已经完成,对番木瓜重要功能基因分析变得日益重要,高质量原生质体获得,并在此基础上建立系统稳定的基因瞬时表达体系,将为基因功能验证提供良好的分析平台,这也意味着果树中模式植物的番木瓜将在生物学相关领域研究发挥极其重要作用。此外,原生质体同时还提供一种单细胞模型去研究病毒侵染和复制相关病理。番木瓜环斑病毒（PRSV,马铃薯Y病毒科,马铃薯Y病毒属）是番木瓜种植区最具破坏性的病害,虽然转CP基因番木瓜抗PRSV一般被认为是长期控制病毒的策略,但不同地区病毒株系存在差异,这限制了转基因番木瓜的推广与应用。为进一步了解相关PRSV侵染,PRSV介导的基因沉默以及PRSV与宿主相互作用从而制定出新的抗病策略,那么利用分离获得高质量原生质体这一单细胞侵染模型,进一步对番木瓜侵染与复制机理研究尤为重要。本论文以番木瓜实生苗幼嫩叶片为材料,系统考察并研究了影响番木瓜原生质体分离与PEG介导的原生质体瞬时表达相关重要因子,并初步建立了番木瓜叶肉原生质体瞬时表达体系,为进一步的细胞与分子生物学实验操作奠定了基础。一些非生物关键因素,如酶的混合液浓度、酶解时间与酶液pH值,直接影响植物原生质体分离。每种植物均存在特定的最佳分离条件,迄今,已有许多报到关于不同植物最佳原生质体分离条件报到,然而目前在番木瓜叶肉细胞原生质体分离上,Kumrop（1998）[1]曾获得8.4±0.6×106g-1FW叶肉原生质体产量,而Janjira（2003）[2]也曾报道从番木瓜叶片中获得2.33±0.69×106g-1FW叶肉原生质体产量以及82%的存活率,但我们可以看出其原生质体产量与存活率并不十分理想,原生质体产量以及存活率都有很大提高的空间。本研究以采用正交实验设计研究酶混合液浓度、甘露醇浓度、酶解时间对番木瓜叶肉原生质体分离影响,优化了原生质体分离条件。结果显示,Cellulase R-10浓度与酶解时间是影响原生质体产量的关键因子,D-mannitol浓度对原生质体存活率起重要作用。同时对酶液pH值单因子实验发现,酶液pH值对原生质体产量和存活率影响显著。番木瓜叶肉原生质体分离最佳条件是酶混合液组成为1.2%纤维素酶+0.3%离析酶,甘露醇浓度为0.44 M,酶液pH值为5.8,23℃恒温摇床60rpm酶解13h,在此条件下其分离获得原生质体最高产量为1.745x107个.g-1FW,存活率高达90%。在此基础上,本研究继续对PEG介导的番木瓜叶肉原生质体瞬时基因表达主要影响因子进行了研究,考察了PEG分子量、PEG浓度,PEG作用时间、质粒浓度等因素对瞬时表达率的影响。结果表明：以16μg质粒HBT95-SGFP（S65T）-NOS,终浓度20%PEG8000,处理10 min,原生质体浓度为2×105个/mL,培养方式为23℃,培养24h,平均转化率可达70%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词
• 1 前言
• 1.1 植物原生质体瞬时表达系统应用
• 1.2 植物原生质体
• 1.2.1 植物材料选择
• 1.2.2 酶液种类及其使用浓度
• 1.2.3 渗透稳定剂
• 1.2.4 酶液pH值
• 1.3 DNA直接导入法转化植物原生质体
• 1.3.1 PEG介导的转化
• 1.3.2 电击法介导的基因转化
• 1.4 绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein,GFP）
• 1.4.1 绿色荧光蛋白结构
• 1.4.2 绿色荧光蛋白分子改造
• 1.4.3 绿色荧光蛋白发光特性影响因素
• 1.5 本实验研究内容
• 1.5.1 理想受体系统建立——番木瓜原生质体分离
• 1.5.2 原生质体瞬时表达体系建立
• 2 实验材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株与质粒
• 2.1.3 主要仪器与设备
• 2.1.4 主要细胞与分子生物学试剂
• 2.1.5 实验关键试剂配方
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 番木瓜叶肉原生质体分离纯化
• 2.2.2 原生质体产量与活力测定
• 2.2.3 番木瓜叶肉原生质体GFP基因瞬时表达
• 2.2.3.1 HBT95—SGFP-NOS质粒的提取
• 2.2.3.2 PEG介导的GFP基因遗传转化
• 3 实验结果
• 3.1 番木瓜叶肉原生质体分离条件优化
• 3.1.1 叶肉原生质体分离纯化与活力检测
• 3.1.2 酶、甘露醇浓度以及酶解时间对番木瓜叶肉原生质体分离影响
• 3.1.3 pH值对叶肉原生质体分离的影响
• 3.2 番木瓜叶肉原生质体瞬时表达研究
• 3.2.1 质粒HBT95-SGFP（S65T）-NOS提取
• 3.2.2 番木瓜叶肉原生质体基因瞬时表达情况
• 3.2.3 PEG介导的番木瓜叶肉原生质体瞬时表达体系建立
• 3.2.3.1 PEG分子量对番木瓜叶肉原生质体基因瞬时表达率影响
• 3.2.3.2 PEG终浓度变化对番木瓜叶肉原生质体瞬时表达率影响
• 3.2.3.3 PEG处理时间对番木瓜叶肉原生质体基因瞬时表达率影响
• 3.2.3.4 质粒DNA对番木瓜叶肉原生质体基因瞬时表达率影响
• 3.2.4 融合蛋白荧光信号的检测
• 3 分析与讨论
• 3.1 番木瓜叶肉原生质体分离优化
• 3.1.1 植物材料选择与生理状态
• 3.1.2 "酶浓度-酶解时间"合理配比
• 3.1.3 甘露醇浓度
• 3.1.4 酶液pH值
• 3.2 番木瓜叶肉原生质体遗传转化的影响因素
• 3.2.1 PEG种类与浓度
• 3.2.2 PEG作用时间
• 3.2.3 质粒DNA浓度
• 结论
• 参考文献
• 后记