导读:本文包含了葡激酶纯化论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:重组葡激酶,人α微球蛋白,RGD,融合蛋白
葡激酶纯化论文文献综述
苟冶然,龙小滨,白磊,何泉,陈检[1]（2015）在《RGD-重组葡激酶-人α微球蛋白融合蛋白原核表达、纯化及鉴定》一文中研究指出目的构建RGD-重组葡激酶-人α微球蛋白融合蛋白的原核表达质粒,在大肠杆菌中表达融合蛋白,纯化并初步鉴定其生物学活性。方法利用重迭延伸PCR获得目的融合基因片段RGD-r SAK-α1M,插入带有His-GST标签的原核高效可溶性表达载体PEGX-6P-1中。经酶切鉴定后,将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21菌株,IPTG诱导目的蛋白表达,经Ni+亲和层析柱纯化后用3C蛋白酶切除重组蛋白的His-GST标签,再利用DEAE离子交换柱和分子筛纯化蛋白。最后应用纤维蛋白平板溶圈法和血小板聚集抑制试验分别测定评价重组融合蛋白的溶栓活性和抗血小板聚集作用。结果 1)成功构建了RGD-重组葡激酶-人α微球蛋白融合蛋白。2)实现了目的融合蛋白在大肠杆菌上清液中的高效表达,并纯化了融合蛋白。3)体外实验表明纯化后的融合蛋白纤溶活性同尿激酶标准品无明显差异。4)融合蛋白抗血小板聚集作用较单纯重组葡激酶明显提高。结论经文献检索确认为首次获得了纯化的RGD-重组葡激酶-人α微球蛋白融合蛋白,并验证了其纤溶活性和尿激酶标准品无明显差异,而抗血小板聚集作用较单纯重组葡激酶增强,为下一步进行融合蛋白免疫原性鉴定奠定了基础。(本文来源于《基础医学与临床》期刊2015年03期）
陈检,杨可,郭珍,张阳丽,张绍成[2]（2013）在《重组葡激酶-人HC蛋白融合蛋白的原核表达、纯化及功能鉴定》一文中研究指出目的表达和纯化重组葡激酶-人HC蛋白融合蛋白,并初步鉴定其生物学活性。方法利用重迭延伸PCR方法使基因重组获得目的基因片段,插入带有GST标签的原核高效可溶性表达载体pEGX-6P-1中,构建重组表达质粒pEGX-6P-1-SAK-HC,将重组表达质粒转化大肠杆菌B834,经IPTG诱导目的蛋白表达;对融合蛋白用谷胱甘肽琼脂糖凝胶柱(GST)亲和层析柱及DEAE离子交换柱纯化,用PreScission蛋白酶切除GST标签,以SDS-PAGE分析该融合蛋白的表达量和纯度,应用纤维蛋白平板溶圈法测定评价其生物学活性。结果构建的重组表达质粒经PCR、内(本文来源于《第15届中国南方国际心血管病学术会议专刊》期刊2013-04-11）
陈检,杨可,郭珍,张阳丽,张绍城[3]（2012）在《重组葡激酶-人HC蛋白融合蛋白的原核表达、纯化及鉴定》一文中研究指出目的:表达和纯化重组葡激酶-人HC蛋白融合蛋白,并初步鉴定其生物学活性。方法:利用重迭延伸PCR方法使基因重组获得目的基因片段,插入带有GST标签的原核高效可溶性表达载体pEGX-6P-1中,构建重组表达质粒pEGX-6P-1-SAK-HC,将重组表达质粒转化大肠杆菌B834,经IPTG诱导目的蛋白表达;对融合蛋白用谷胱甘肽琼脂糖凝胶柱(GST)亲和层析柱及DEAE离子交换柱纯化,用PreScission蛋白酶切除GST标签,SDS-PAGE分析该融合蛋白的表达量和纯度,应用纤维蛋白平板溶圈法测定评价其生物学活性。结果:构建的重组表达质粒经PCR、内切酶鉴定及基因序列测定证实,目的蛋白在大肠杆菌中获得表达,SDS-PAGE显示相对分子质量(Mr)为36 000;对表达产物进行了亲和层析纯化,从上清中获得了纯度较高的葡激酶-人HC蛋白融合蛋白,体外实验显示其纤溶活性为9.4×104IU/mg。结论:获得了可溶性的葡激酶-人HC蛋白融合蛋白,且其纤溶活性与尿激酶标准品相当。为下一步进行融合蛋白免疫原性鉴定奠定了基础。(本文来源于《细胞与分子免疫学杂志》期刊2012年11期）
杨可[4]（2012）在《重组葡激酶的表达纯化及其纤溶活性的鉴定》一文中研究指出目的：构建葡激酶（Staphylokinase, SAK）基因的原核表达质粒，在大肠杆菌原核表达系统中表达SAK蛋白，检测其蛋白质的表达情况，纯化该蛋白质并初步鉴定其生物学活性，为临床血栓性疾病的治疗提供可能的溶栓新药。方法：基于生物信息学方法，分析优化基因序列，使用基因合成技术合成葡激酶的基因序列，连接表达载体，转化感受态大肠杆菌克隆菌株DH-5α，运用PCR的方法筛选阳性克隆，提取双酶切阳性的质粒，并转化感受态大肠杆菌BL21菌株，使含有葡激酶目的基因的质粒在ＢＬ２１大量表达目的蛋白－葡激酶，利用离子交换柱(DEAE)，分子筛(Superdex75)等进行分离纯化，并用紫外核酸蛋白仪检测目的蛋白的浓度，应用纤维蛋白平板溶圈法测定并评价其溶栓生物活性。结果：葡激酶在大肠杆菌中以可溶上清的方式高效表达，利用离子交换柱和分子筛等纯化效果良好，纯度达95%，以紫外核酸蛋白仪测蛋白浓度为2.05mg/mL。体外实验显示其纤溶活性与尿激酶标准品相当。结论：（1）应用全基因合成经过优化的SAK基因可在原核表达体系（大肠杆菌系统）中高效的以可溶性上清的方式高效表达。（2）以基因合成技术合成的SAK基因所表达的葡激酶具有与尿激酶标准品相当的纤溶活性。(本文来源于《重庆医科大学》期刊2012-05-01）
杨可,杨震,汪德强,雷寒,周建中[5]（2012）在《重组葡激酶的表达纯化及纤溶活性鉴定》一文中研究指出目的:构建葡激酶(Staphylokinase,SAK)基因的原核表达质粒,在大肠杆菌中表达SAK蛋白质,纯化并初步鉴定其生物学活性。方法:基于生物信息学方法分析优化基因序列,使用基因合成技术合成SAK基因,转化感受态大肠杆菌B834菌株,使在其中表达,利用离子交换柱,分子筛(Superdex 75)等进行分离纯化,应用纤维蛋白平板溶圈法测定评价其生物活性。结果:SAK在大肠杆菌中以可溶上清的方式高效表达,利用离子交换柱和分子筛等纯化效果良好,纯度达95%,体外实验显示其纤溶活性与尿激酶标准品相当。结论:应用全基因合成经过优化的基因可在大肠杆菌系统中高效上清表达具有较高纤溶活性的SAK。(本文来源于《重庆医科大学学报》期刊2012年03期）
张光满,秦宜德,于爱平[6]（2010）在《重组葡激酶-水蛭素融合蛋白的分离纯化工艺建立》一文中研究指出目的建立大肠杆菌高密度表达的重组葡激酶-水蛭素融合蛋白(STH)分离纯化工艺。方法高密度培养重组大肠杆菌并诱导表达STH,离心收集菌体,反复冻融后收集上清液经超滤、两步阴离子交换层析,分离纯化STH目的蛋白。结果纯化后的STH纯度为98%以上,纤溶比活性2.6×104IU/mg,活性回收率56%。结论建立了STH的纯化工艺,该纯化工艺简便,时程短,重复性好,适合于大规模生产。(本文来源于《安徽医科大学学报》期刊2010年04期）
狄静芳,贺进田,徐瑞光,陈希,赵宝华[7]（2009）在《N-末端引入RGD序列的葡激酶突变体表达、纯化及性质研究》一文中研究指出为解决葡激酶存在的溶栓后再栓塞问题,利用PCR介导的定点突变技术,在野生型葡激酶(wt-SAK)N-末端的第3、4位氨基酸之间插入Arg-Gly-Asp(RGD)序列构建了葡激酶突变体MD2-SAK,另将N-末端的前3位氨基酸替换为RGD序列构建了葡激酶突变体MD4-SAK。将突变体基因分别连接表达载体pBV220,转化大肠杆菌DH5α,经过热激诱导后,突变体均以可溶性形式得到高效表达,表达蛋白占菌体总蛋白的50%以上。破菌上清液通过SP-Sepharose FF、Sephadex G-50和Q-Sepharose FF叁步连续的色谱层析纯化得到纤溶活性分别为10.1×10~4 AU/mg、11.2×10~4 AU/mg,纯度均大于96%的突变体蛋白。进一步研究了突变体的性质,结果表明葡激酶突变体不仅保留了野生型葡激酶的纤溶酶原激活活性,并具有较强的抗血小板聚集活性。同时发现,葡激酶突变体的N-末端序列会影响其N-末端甲硫氨酸的酶切加工。(本文来源于《高技术通讯》期刊2009年01期）
狄静芳,贺进田,徐瑞光,陈希,赵宝华[8]（2008）在《具有抗血小板聚集功能的新型葡激酶突变体的表达、纯化及性质》一文中研究指出【目的】为解决溶栓后再栓塞问题,构建N-端含RGD(Arg-Gly-Asp)序列的葡激酶双功能突变体。研究突变体的表达和纯化,并进行性质分析。【方法】将突变后的葡激酶突变体序列连入pBV220质粒,转化大肠杆菌BL21进行表达。阳离子交换、凝胶过滤和阴离子交换叁步层析法纯化表达产物,采用溶圈法对纯化产物进行生物学活性测定,并测定纯化产物对血小板聚集的抑制效应。【结果】PAGE扫描结果显示,葡激酶突变体蛋白在大肠杆菌BL21中的表达量约占菌体蛋白总量的40%～50%;叁步层析纯化后,HPLC测定其纯度可达95%。酪蛋白凝胶板溶圈法测得其比活性分别为10.8×104和11.0×104HU/mg,与野生型葡激酶活性相当;且具有明显的抗血小板聚集活性,血小板聚集仪测定其血小板聚集抑制率分别为10.72%和19.71%,明显高于野生型葡激酶血小板聚集抑制率。本实验利用pBV220载体高效表达了葡激酶突变体基因,得到了高纯度、高活性的突变体蛋白,为葡激酶生产产业化和临床应用奠定了良好的基础。(本文来源于《微生物学报》期刊2008年09期）
宋磊,刘红军,刘宁[9]（2008）在《葡激酶在毕赤酵母中的表达及纯化》一文中研究指出目的探索葡激酶基因在毕赤酵母中的表达和纯化方法。方法根据毕赤酵母的偏性合成了葡激酶基因,克隆到分泌型酵母表达载体pPIC9K中,重组载体线性化后,转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达。应用DEAE-Sepharose FF、Q-Sepharose FF和Sephacry1 S-200凝胶过滤层析法纯化表达产物,采用溶圈法对纯化产物进行生物学活性测定。结果葡激酶在毕赤酵母中GS115的表达量约站总蛋白的45%;表达产物经DEAE-Sepharose FF、Q-Sepharose FF和SephacrylS-200纯化后纯度达到95%;测得其比活为5.2×104AU/mg。结论利用毕赤酵母成功进行了重组葡激酶基因的表达及其表达产物的纯化。(本文来源于《中国实用医药》期刊2008年24期）
狄静芳[10]（2008）在《N-端引入RGD序列的葡激酶突变体的构建、表达、纯化及性质研究》一文中研究指出血栓性疾病特别是脑血栓、心肌梗塞、深度静脉血栓等均有较高的致死、致残率,溶栓治疗法是治疗此类疾病的常规疗法。自从二十世纪八十年代以来,已先后开发了多种溶栓制剂,现已被广泛应用于临床,例如:重组组织型纤溶酶原(recombinant tissue-type plasminogen activator,rt-PA)、尿激酶(UK)、重组链激酶(recombinant streptokinase,r-SK)等,这些溶栓制剂各有优缺点,其中以rt-PA疗效最佳,但因其价格昂贵使用范围受到很大限制。科研工作者正在努力寻找一种既有较好溶栓疗效价格又便宜的新一代溶栓制剂。天然葡激酶(staphylokinase,SAK)是金黄色葡萄球菌溶原性噬菌体合成的一种蛋白质。临床研究表明,重组葡激酶(r-SAK)具有与rt-PA相当的溶栓活性,且有更高的纤维蛋白专一性,除此之外,它能在大肠杆菌中高效表达,生产成本低,是一种很有应用前景的溶栓制剂。但临床试验表明,使用r-SAK后仍有一定的再梗塞率,而活化后血小板聚集反应是成功溶栓后再栓塞的主要原因,因此在溶栓的同时进行抗凝、抗血小板聚集治疗是一种积极的预防再栓塞的治疗策略。GPIIb/IIIa拮抗剂能与纤维蛋白原竞争性结合血小板表面的GPIIb/IIIa受体,能够抑制血小板聚集通路的最后一步,具有很强的抑制血小板聚集的作用。国内外根据RGD(Arg-Gly-Asp)序列已设计了许多GPIIb/IIIa受体阻断剂,用于抑制血小板聚集。为研制兼具溶栓和防栓功能的新型溶栓剂,降低溶栓后再栓塞的发生率,本试验设计在SAK分子的N-端引入RGD序列,构建四个新型双功能SAK突变体分子,研究其表达和纯化,并分析其生物学活性。本实验采用PCR介导的定点突变的方法,通过设计N-端包含RGD短肽序列的突变引物,以野生型葡激酶(wild type staphylokinase,WT-SAK)质粒为模板,PCR克隆得到SAK突变体基因;将突变后的SAK基因序列与表达载体pBV220质粒连接后,转化大肠杆菌BL21进行表达;应用阳离子交换层析、凝胶过滤层析和阴离子交换层析连续叁步层析法纯化表达产物,并对所得纯化产物进行生物学活性鉴定。实验结果显示,SAK突变体蛋白在大肠杆菌BL21中的表达量占菌体蛋白总量的50%以上;叁步连续层析纯化后其纯度可达97%以上;测得其纤溶比活性分别为10.8×104HU/mg、10.1×104HU/mg、11.0×104HU/mg、11.2×104HU/mg,不低于WT-SAK的纤溶活性(9.8×104HU/mg);并且具有明显的抗血小板聚集活性,实验测得血小板聚集抑制率分别为10.72%、12.36%、19.71%、21.65%,明显高于WT-SAK(3.98%);ELISA分析结果表明,SAK突变体中大肠杆菌菌体蛋白残留量均小于0.1%,符合《中国药典》2005版中规定的要求。本实验中,突变体基因在大肠杆菌中获得高效表达,得到了高纯度、高活性的SAK突变体蛋白。突变体既保留了野生型葡激酶的纤溶活性,同时又具有了抗血小板聚集功能,为新型双功能SAK的研制奠定了良好的基础。(本文来源于《河北师范大学》期刊2008-05-20）
葡激酶纯化论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
目的表达和纯化重组葡激酶-人HC蛋白融合蛋白,并初步鉴定其生物学活性。方法利用重迭延伸PCR方法使基因重组获得目的基因片段,插入带有GST标签的原核高效可溶性表达载体pEGX-6P-1中,构建重组表达质粒pEGX-6P-1-SAK-HC,将重组表达质粒转化大肠杆菌B834,经IPTG诱导目的蛋白表达;对融合蛋白用谷胱甘肽琼脂糖凝胶柱(GST)亲和层析柱及DEAE离子交换柱纯化,用PreScission蛋白酶切除GST标签,以SDS-PAGE分析该融合蛋白的表达量和纯度,应用纤维蛋白平板溶圈法测定评价其生物学活性。结果构建的重组表达质粒经PCR、内
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
葡激酶纯化论文参考文献
[1].苟冶然,龙小滨,白磊,何泉,陈检.RGD-重组葡激酶-人α微球蛋白融合蛋白原核表达、纯化及鉴定[J].基础医学与临床.2015
[2].陈检,杨可,郭珍,张阳丽,张绍成.重组葡激酶-人HC蛋白融合蛋白的原核表达、纯化及功能鉴定[C].第15届中国南方国际心血管病学术会议专刊.2013
[3].陈检,杨可,郭珍,张阳丽,张绍城.重组葡激酶-人HC蛋白融合蛋白的原核表达、纯化及鉴定[J].细胞与分子免疫学杂志.2012
[4].杨可.重组葡激酶的表达纯化及其纤溶活性的鉴定[D].重庆医科大学.2012
[5].杨可,杨震,汪德强,雷寒,周建中.重组葡激酶的表达纯化及纤溶活性鉴定[J].重庆医科大学学报.2012
[6].张光满,秦宜德,于爱平.重组葡激酶-水蛭素融合蛋白的分离纯化工艺建立[J].安徽医科大学学报.2010
[7].狄静芳,贺进田,徐瑞光,陈希,赵宝华.N-末端引入RGD序列的葡激酶突变体表达、纯化及性质研究[J].高技术通讯.2009
[8].狄静芳,贺进田,徐瑞光,陈希,赵宝华.具有抗血小板聚集功能的新型葡激酶突变体的表达、纯化及性质[J].微生物学报.2008
[9].宋磊,刘红军,刘宁.葡激酶在毕赤酵母中的表达及纯化[J].中国实用医药.2008
[10].狄静芳.N-端引入RGD序列的葡激酶突变体的构建、表达、纯化及性质研究[D].河北师范大学.2008