超声引导不可逆性电穿孔消融山羊肝脏组织的实验研究

论文摘要

电穿孔（electroporation）是指一定场强（kV/cm级）、脉宽（μs-ms级）的脉冲电场作用下,细胞膜的脂质双分子层重新排列形成了一些被称为微孔的亲水性通道,使许多平时不能穿越的亲水性大分子能顺利通过。根据外加脉冲电场撤消后细胞膜能否恢复到正常生理状态,电穿孔可分为可逆性电穿孔（reversible electroporation,RE）和不可逆性电穿孔（irreversible electroporation,IRE）。RE是电化学疗法（electrochemotherapy,ECT）和基因电转染技术的理论基础;IRE是在ECT基础上发展起来的,通过提高电场能量使处理区细胞膜发生不可逆性穿孔,达到杀灭肿瘤细胞的目的,为摆脱化疗药物的耐药性、毒副反应,单独使用脉冲电场治疗肿瘤带来了希望。微秒级不可逆性电穿孔技术细胞效应机制独特,前期研究已经证实该方法的有效性及其广阔的应用前景,但电场的施加必须以电极针为传导介质,既往研究多数是针对体表病变或开腹进行消融治疗,一定程度上阻碍了IRE技术的临床应用。基于无创的医学影像技术为IRE的发展带来了新的思路,超声、CT、MRI在深部肿瘤的局部治疗中能起到引导、定位、监测等作用,其中超声因其使用方便、价格经济而使用广泛。为推进IRE技术的临床化进程,本实验在已有细胞及小动物实验的基础上,选择大型动物山羊为对象,试图采用超声影像引导,实时监测电极针穿刺,靶向消融肝脏组织,分别从组织定位的准确性、靶向组织的损伤、超声影像学变化特点、超声测量靶区径线的准确性进行评估,并探讨消融术后靶区的组织学变化特点等,对微创IRE治疗技术的可行性、有效性及安全性进行较全面的实验研究,解决IRE临床应用难题。本研究在国内尚属空白,有一定的创新性。第一部分:超声引导不可逆性电穿孔消融山羊肝脏组织的可行性及安全性探讨第一节:IRE消融正常山羊肝脏组织的参数筛选目的:筛选固定场强、脉宽及频率的IRE消融正常山羊肝脏组织的最适宜电场参数。方法:采用针距2cm的两针电极,固定脉宽100μs、频率1Hz、电压2000V,梯度改变脉冲个数30-150个脉冲,每次递增30个脉冲的IRE作用于开腹后的山羊肝脏,肉眼观察处理区轮廓与仿真电场相的吻合度,多路温度巡检仪测量处理前后处理区温度变化。24h后处死动物,处理区TTC染色,游标卡尺测量不着色区最大坏死径线。结果:消融区径线随着脉冲个数的增加逐渐扩大,围绕电极针的两个圆形消融区逐步融合,当脉冲增加至120个时,消融范围趋于稳定,坏死区域轮廓与针状电极的有限元仿真电场FEMLAB分布基本吻合。120个脉冲组与30个、60个、90个脉冲组最大坏死径线均有统计学差异（P<0.05）,而120个脉冲处理组与150个脉冲组之间的最大坏死轮廓径线大小无统计学意义（P>0.05）,120个脉冲可能是该参数下IRE剂量作用的一个饱和点。消融区温度在IRE作用前后无明显差别（P>0.05）,均在组织热损伤温度以下。结论:针距2cm的两针电极,固定脉宽100μs、频率1Hz和电压2000V的条件下,IRE消融在体山羊肝脏的最佳脉冲个数是120个。IRE技术具有非热效应,呈现出与传统的温度依赖的肿瘤消融技术不同的独特优势,不受血液流动热沉效应的影响。第二节:超声引导IRE消融山羊肝脏组织的可行性及B超影像学变化特点目的:探讨超声引导经皮穿刺微创IRE消融山羊肝脏组织的可行性以及B超影像学变化特点。方法:固定脉宽100μs,频率1Hz,电压2000V,脉冲数120个,彩色超声探头引导电极针经皮穿刺山定位靶区羊肝脏组织,施加脉冲电场。观察IRE处理后即刻、24小时、3天、7天、14天靶区肝脏组织大体标本以及超声灰度变化。结果:超声引导经皮IRE消融靶区组织定位准确,电极针显影清楚。IRE消融后即刻与正常肝脏组织回声强度相比较,治疗区域呈低强度回声,靠近电极针处回声稍高,处理区域界限清晰。治疗后24h,回声强度变化范围较处理后即刻有所缩小,回声强度增高,呈稍高强度回声。IRE消融后3d,处理区回声强度较24h略有升高,边界更加清晰。IRE消融术后7天复查B超,处理区较前缩小,呈高回声,此时回声强度最高,消融边界在新增生的纤维结缔组织的牵扯下变得不规则。术后14天复查B超时,消融区较前明显缩小,回声强度也有所下降,呈稍高回声表现,超声回声杂乱,不均质,其内见点状高回声,消融区坏死组织被机化吸收。各时间点的肝脏靶区超声回声变化区域轮廓与大体标本基本一致。结论:采用无创性的超声影像监测引导技术,实验中可以清楚观察到电极针的进针深度及位置,定位准确。在IRE消融后即刻以及术后,靶区超声影像存在规律性的变化,超声有希望作为IRE消融肝脏组织术中监测以及术后进行随访的有效手段。将超声引导与不可逆性电穿孔治疗结合使IRE微创消融体内深部肿瘤成为可能,确保了治疗的安全性。第三节:超声引导IRE消融山羊肝脏组织的安全性探讨目的:研究IRE消融山羊肝脏对山羊全身情况的影响,探讨IRE消融技术的安全性。方法:固定脉宽100μs,频率1Hz,电压2000V,脉冲数120个。彩色超声探头引导电极针经皮定位穿刺处理山羊肝脏组织,施加脉冲电场,比较术前、术后即刻的心率、呼吸、心电生理（ECG）变化。同时经耳缘静脉抽血,评价IRE处理后即刻、24小时、3天、7天、14天不同时间点术后并发症、肝功能、肾功能、全血细胞计数、心肌酶谱（CK-MB）变化。结果:脉冲电场实施过程中,山羊的呼吸频率和心率较处理前平静时有所增高,治疗结束后,呼吸节律和心率逐渐恢复正常。消融前和消融后即刻,山羊自身前后比较差异无显著性（P>0.05）。IRE消融后24小时至3天山羊肝功ALT、AST呈一过性增高,至术后7天逐渐降低至正常水平,所有肝功能、肾功能、全血细胞计数、心肌酶谱（CK-MB）指标治疗前后差异无显著性（P>0.05）。IRE消融术后山羊复查ECG结果正常,所有山羊无术后心率失常发生、未发现腹腔内出血、感染、肝脏周围邻近器官（胆囊、大网膜、肠管等）损伤。结论:超声引导IRE微创消融靶区组织安全可行,消融定位准确、范围可控、边界清楚且不会对周围邻近器官造成损伤。第二部分:超声对IRE消融山羊肝脏靶区的监测意义目的:研究通过超声影像学变化特点,利用超声实时监测经皮穿刺微创IRE消融山羊肝脏组织靶区范围的准确性和可控性。方法:固定脉宽100μs、频率1Hz、电压2000V,电极针距2cm,脉冲个数120个。超声探头引导电极针经皮定位穿刺处理山羊肝脏组织,测量电场处理后即刻靶区回声变化范围的最大径线D1。消融后24小时复查B超,测量IRE后24小时靶区回声变化范围的最大径线D2。过量麻醉剂处死山羊,电子游标卡尺测量处理区实际最大消融径线D3。分别比较以上三种测量径线之间的关系并且与第一部分第一节山羊开腹直视下相同参数消融24h后测得最大消融径线D4进行比较分析。结果:①山羊开腹直接消融后24h测得的120脉冲组最大消融直径D4[（35.96±2.52）mm]较超声引导IRE经皮微创消融后24h山羊标本的实际最大消融直径D3无显著差异（P>0.05）。②D1、D2、D3三组数据中,IRE处理后即刻超声测量回声变化范围最大径线D1[（39.58±2.13）mm]数值最大,其次为24h后超声回声变化最大径线D2[（37.07±3.51）mm],两者之间差异具有统计学意义（P<0.05）;处理后24h肝脏取材测量的实际最大消融径线D3[（36.44±2.04）mm]最小,但是与D2没有显著差异（P>0.05）。IRE处理后即刻超声回声变化最大径线D1与处理后24h肝脏实际测量到的最大消融径线D3呈线性相关（r=0.949）。结论:超声引导电极针经皮穿刺定位消融山羊肝脏靶区与直视下消融效果一致。在对靶区消融范围实时监测的过程中,超声用于测量靶区实际消融径线准确可行。IRE后即刻,超声测量消融范围径线较IRE后24h超声测量及实际标本测量径线显著偏大;但是和实际测量的消融范围径线之间存在良好的线性关系。通过实时B超监测可以对消融目标的有效范围进行较为准确的控制。第三部分:IRE消融山羊肝脏的组织学观察第一节:IRE术后肝脏组织学及肝细胞超微结构变化特点目的:评价IRE消融山羊肝脏组织的有效性,探讨IRE消融术后不同时间点肝细胞组织学及电镜超微结构变化特点。方法:固定脉宽100μs,频率1Hz,电压2000V,脉冲数120个,彩色超声探头引导电极针经皮定位穿刺处理山羊肝脏组织。于治疗后即刻、24小时、3天、7天、14天处死动物,取材,行HE、葡萄糖-6-磷酸酶（ Glucose-6-phosphatse,G-6-P ）、琥珀酸脱氢酶（Succinodehydrogenase, SDH）、毛细胆管吡啶银及网状纤维组织化学染色,观察组织细胞形态、两种酶活性产物的变化及IRE处理区毛细胆管及网状纤维的病理改变。电子显微镜观察IRE术后即刻、24小时及3天肝脏超微结构变化。结果:①HE染色显示,IRE处理后即刻靶区内肝细胞胞浆内空泡形成、细胞明显水肿;24小时后观察到处理区肝细胞完全坏死,与周围正常细胞分界清楚,并出现大量炎症细胞浸润;IRE处理后14天,处理区坏死组织主要被肉芽组织填充、机化。②肝脏超微结构证实IRE处理后肝脏组织遭到严重破坏,表现为肝细胞胞膜破裂,线粒体肿胀坏死、粗面内质网扩张、肝血窦毛细血管内皮细胞连续性破坏等改变。③靶区肝细胞酶组织化学染色显示,IRE作用后即刻,G-6-P和SDH活性无明显变化;而24小时后,活性显著降低;3天后活性最低。消融区内毛细胆管结构破坏消失,网状纤维断裂破碎。结论:G-6-P、SDH两种细胞酶学染色,从细胞内功能的改变与HE染色及电镜超微结构观察到肝细胞发生的形态学变化相互印证,充分证实了IRE对靶区细胞的完全非选择性消融效果。IRE可以实现病变区域具有细胞膜性结构成分组织的广泛性作用,同时对其内细胞骨架结构产生较强破坏效果。第二节:IRE对消融区域内血管结构的影响目的:探讨IRE对消融区域内血管结构的影响。方法:固定脉宽100μs,频率1Hz,电压2000V,脉冲数120个,彩色超声探头引导电极针经皮消融山羊肝脏组织。处理后即刻、24小时、3天、7天、14天复查超声了解消融区内血管二维超声及多普勒血流影像学变化。逐层水平切开处理区肝脏组织,肉眼观察到消融区内包含有血管结构即取材,4%多聚甲醛固定,石蜡包埋,行HE、VG及Masson染色组织染色。结果:标本取材后肉眼观察,IRE作用范围区域内血管结构完整（包括管径在10mm以上的肝内大血管和管径在2mm左右的肝内小血管）。血管二维影像提示消融区内的血管连续性完整,走行清晰,CDFI可以观察到血管内彩色多普勒血流频谱。血管组织学染色示内皮细胞连续性完好,血管周围弹性纤维、血管平滑肌结构完整。结论:IRE非热消融治疗后病灶内滋养血管和毛细血管网大量破坏,而靶区内较大血管无损伤或栓塞。脉冲电场不可逆性电穿孔保留了消融区重要的管道结构（如动脉、静脉、胆管）,血管周围的弹性纤维、胶原纤维结构完整。IRE不受血液流动热沉效应的影响,保证电场能量在靶区组织内的有效传递和积累,为生长在大血管周围、手术进行有困难的肿瘤消融提供可能。第三节:IRE致消融区组织细胞凋亡的实验观察目的:观察IRE消融山羊肝脏组织靶区肝细胞坏死、凋亡与电场分布的关系。方法:固定电压2000V、脉宽100μs、频率1Hz,经彩色超声探头引导电极针经皮定位肝脏,施加120个脉冲电场。24h后处死动物,取电极针周围肝脏组织标本（包括脉冲电场处理区域中心部分和处理区域与正常组织交界区）和正常组织（作为对照）。将标本进行处理后,分别行HE染色观察组织的病理学变化;采用DNA ladder和TUNEL法检测组织细胞凋亡,采用流式细胞仪分析细胞周期。结果:病理学观察可见,消融处理区的肝细胞完全坏死,围绕电极针的中心区域呈现凝固性坏死。TUNEL法显示凋亡细胞（细胞核为深黑色,胞质呈淡棕黄色）主要集中在处理区与正常组织的交界区。DNA ladder法在处理区与正常组织交界区组织检测到400-1000bp的梯状条带;流式细胞术分析显示,该区细胞DNA二倍体峰前面出现亚二倍体凋亡峰。结论:采用IRE消融山羊肝脏组织,细胞在电场强度分布最高处（即围绕电极针的中心区域）呈现凝固性坏死;在电极针周边处理区域,随电场强度的衰减,交界区肝细胞还呈现出凋亡途径的细胞程序性死亡（programmed cell death,PCD）。肿瘤组织在脉冲电场消融时被“超范围切除”,可以有益于降低治疗后的复发率及对周边正常组织的侵犯、转移。

论文目录

• 英汉缩略语名词对照
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分：超声引导不可逆性电穿孔消融山羊肝脏组织的可行性及安全性探讨
• 第一节：IRE 消融正常山羊肝脏组织的参数筛选
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 结论
• 第二节：超声引导IRE 消融山羊肝脏组织的可行性及B 超影像学变化特点
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 结论
• 第三节：超声引导IRE 消融山羊肝脏组织的安全性探讨
• 1 实验材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 结论
• 参考文献
• 附图
• 第二部分：超声对IRE 消融山羊肝脏靶区的监测意义
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 结论
• 参考文献
• 第三部分：IRE 消融山羊肝脏的组织学观察
• 第一节：IRE 术后肝脏组织学及肝细胞超微结构变化特点
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 结论
• 第二节 IRE 对消融区域内血管结构的影响
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 结论
• 第三节：IRE 致消融区周边组织细胞凋亡的实验观察
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 结论
• 附图
• 参考文献
• 全文总结
• 文献综述
• 参考文献
• 致谢
• 攻读博士期间发表的论文及科研工作