RelB基因沉默DC对实验性重症肌无力的治疗作用及免疫调节机制研究

论文摘要

第一部分小鼠RelB基因RNA干扰慢病毒载体的构建及对树突状细胞成熟活化的影响目的:构建小鼠RelB基因RNA干扰慢病毒表达载体,探讨其对小鼠骨髓源性树突状细胞RelB表达及成熟活化的影响方法:根据Genebank RelB基因信息,设计了4个小干扰序列和1个阴性对照序列,利用慢病毒载体pGCSIL构建了5个重组质粒并进行了慢病毒包装,分别为LV-SiRelB1,LV-SiRelB2,LV-SiRelB3,LV-SiRelB4,LV-SiNC;感染工具细胞NIH3T3细胞后,荧光定量PCR检测干扰效率,选择干扰效率最高的载体进行慢病毒大量包装。用筛选出的含有效靶点的慢病毒和阴性对照病毒感染小鼠骨髓树突状细胞（BMDC）,并给予LPS刺激,相应的DC命名为RelB-Silenced DC和Control DC;用荧光定量PCR和Western blot检测干扰效率,流式细胞仪检测表面分子CD86、CD80、MHCII,ELISA检测培养上清IL-6,IL-12,IL-23。结果:测序结果证明5种质粒载体的插入序列正确,鉴定证明慢病毒包装成功。慢病毒感染NIH 3T3细胞后,荧光定量PCR证实重组慢病毒LV-SiRelB3的干扰效率最高,对RelB mRNA表达的抑制达82%。荧光定量PCR和Western blot证实LV-SiRelB3感染BMDC可有效抑制DC中RelB mRNA和蛋白表达,抑制率分别达78.8%,75.2%。流式细胞仪和ELISA检测证实,与Control DC相比,RelB-Silenced DC CD86、CD80、MHCII表达及IL-6,IL-12,IL-23分泌水平显著降低。结论:成功构建RelB RNAi重组慢病毒质粒LV-SiRelB3,它能有效抑制小鼠骨髓源性树突状细胞RelB表达及成熟活化,为进一步研究RelB基因沉默DC用于自身免疫性疾病治疗奠定了基础。第二部分RelB基因沉默DC对实验性重症肌无力的治疗作用及免疫调节机制目的:探讨RelB基因沉默DC对实验性自身免疫性实验性重症肌无力的治疗作用及相关免疫调节机制。方法:①RelB基因沉默DC或对照DC与AChR反应性CD4+T细胞共培养,并分别给予T-AChR、Tα146-162肽段、对照抗原OVA刺激,并设立无抗原刺激共培养体系为阴性对照。3H-TdR掺入法检测CD4+T细胞增殖能力。②RelB基因沉默DC或对照DC与AChR反应性CD4+T细胞共培养,并分别给予T-AChR、Tα146-162肽段刺激,收集培养上清用ELISA检测IL-17,IFN-γ,IL-4,IL-10水平。③以第0,30,60天皮下注射（T-AChR+CFA）抗原乳剂免疫C57BL/6小鼠的方法诱导EAMG动物模型。距初次免疫70天选取EAMG临床评分达1-2分的C57BL/6小鼠随机分为治疗组和治疗对照组,每组12只。治疗组于入组后0,7,14天静脉注射负载Tα146-162的RelB-Silenced DC,治疗对照组于入组后0,7,14天静脉注射等量负载Tα146-162的Control DC。④入组后第20天,取静脉血用ELISA方法检测抗AChR IgG,IgG1,IgG2b,IgG2c滴度。⑤入组后第21天处死小鼠,取脾细胞用3H-TdR掺入法检测淋巴细胞增殖反应,ELISA检测IL-17,IFN-γ,IL-4,IL-10水平,Western blot检测Th17,Th1,Th2,Treg细胞相应特异转录因子RORγt,T-bet,GATA-3,FoxP3表达水平。结果:①在无抗原及对照抗原OVA存在时,AChR反应性CD4+T细胞呈现低增殖反应;在T-AChR及Tα146-162存在时,AChR反应性CD4+T细胞呈现高增殖反应;与对照DC共培养体系相比,RelB基因沉默DC共培养体系CD4+T细胞增殖反应显著降低。②与对照DC共培养体系相比,RelB基因沉默DC与AChR反应性CD4+ T共培养后,培养上清IL-17、IFN-γ水平显著降低,而IL-4,IL-10水平显著增高。③与对照DC治疗组相比,RelB基因沉默DC治疗组小鼠平均临床评分显著降低,血清抗AChR IgG,IgG1,IgG2b滴度显著减低。④与对照DC治疗组相比,RelB基因沉默DC治疗组脾淋巴细胞增值反应显著降低,Th17细胞标志物（IL-17,RORγt）和Th1细胞标志物（IFN-γ,T-bet）显著减低,Th2细胞标志物（IL-4,GATA3）、Treg细胞标志物（FoxP3）水平显著增高。结论:RelB基因沉默DC治疗可以有效减轻实验性重症肌无力的肌无力程度及病理性自身抗体水平,其机制与RelB基因沉默DC减轻淋巴细胞增殖反应、促使Th细胞由Th17,Th1向Th2,Treg极化有关。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 小鼠RelB基因RNA干扰慢病毒载体的构建及对髓源树突状细胞成熟活化的影响
• 1 实验材料
• 1.1 试验动物
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器与设备
• 2 实验方法
• 2.1 RelB RNAi慢病毒载体的构建
• 2.2 RNAi慢病毒载体病毒包装
• 2.3 慢病毒质粒转染NIH3T3细胞筛选有效干扰靶点
• 2.4 慢病毒质粒转染小鼠髓源树突状细胞
• 2.5 Real-time PCR检测DC RelB mRNA表达
• 2.6 Western blot检测DC RelB蛋白表达
• 2.7 流式细胞仪检测DC共刺激分子、MHC Ⅱ分子表达
• 2.8 ELISA检测DC IL-6,IL-12,IL-23分泌水平
• 2.9 分析及统计方法
• 3 结果
• 3.1 RelB慢病毒shRNA载体的构建和鉴定
• 3.2 重组慢病毒载体的包装与滴度测定
• 3.3 RelB RNA干扰有效靶点的筛选
• 3.4 慢病毒感染对小鼠髓源DC成熟活化的影响
• 4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 第二部分 RelB基因沉默DC对实验性重症肌无力的治疗作用
• 1 实验材料
• 1.1 试验动物
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器与设备
• 2 实验方法
• 2.1 CD4+T细胞的制备
• 2.2 RelB-Silenced DC和Control DC制备
• 2.3 CD4+ T细胞和RelB-Silenced DC/Control DC共培养
• 2.4 EAMG模型制备
• 2.5 RelB-Silenced DC、Control DC体外负载Tα 146-162肽段
• 2.6 动物分组
• 2.7 抗AChR抗体测定
• 2.8 AChR特异性淋巴细胞增殖反应和细胞因子反应检测
• 2.9 Western-blot检测Th17,Th1,Th2,Treg细胞亚群特异性转录因子
• 2.10 分析及统计方法
• 3 结果
• 3.1 免疫磁珠法分选CD4+T细胞的纯度鉴定
• +T细胞增殖的影响'>3.2 DC对AChR反应性CD4⁺T细胞增殖的影响
• 3.3 DC:T共培养上清细胞因子测定
• 3.4 实验小鼠的临床评分变化
• 3.5 实验小鼠血清中抗AChR抗体的变化
• 3.6 RelB-Silenced DC对EAMG小鼠抗原特异性增殖反应的影响
• 3.7 RelB-Silenced DC对EAMG小鼠T细胞亚群的影响
• 4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 综述一
• 综述二
• 致谢
• 攻读学位期间的主要学术成果