滑菇（pholiota namek）漆酶的诱导、纯化、cDNA克隆及表达

论文摘要

漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，广泛存在于真菌中。它可以降解木质素和许多酚类有毒物质，在造纸、环保方面具有广泛的应用前景。本文以白腐担子菌滑菇的漆酶为研究对象，对它进行了培养条件、分离纯化、克隆和外源表达等方面的研究。采用国内外文献中常用的A、B、C、D四种产酶培养基对滑菇进行产酶培养，通过多批次多平行样的培养，得出D培养基不仅酶活高而且成分最清楚，是四种培养基中的最佳产酶培养基；以D培养为基础改变碳氮源比例，设计HNHC、HNLC、LNHC、LNLN四种培养基，对四种培养基进行诱导产酶比较，得出HNHC培养基为最佳诱导培养基；以HNHC为基础，改变培养基中的氮源，分别使用硝酸铵，天冬酰胺，尿素，酵母浸膏为氮源，得出天冬酰胺为最佳氮源。在培养基中加入锰离子和铜离子至终浓度为0.05mmol／L-8mmol／L，经过间隔取样可知：低浓度的铜离子（小于1mmol／L）可以诱导滑菇漆酶产生，高浓度的铜离子（大于1mmol／L）抑制滑菇漆酶的产生。低浓度的锰离子（小于等于1mmol／L）对滑菇漆酶的产生影响较小，虽没有促进作用，但也几乎没有抑制作用。高浓度的锰离子（大于等于1mmol／L）明显的抑制滑菇漆酶的产生。采用离子交换柱层析和分子筛这两种分离纯化方法对粗酶液进行分离纯化，所得到的蛋白用SDS-PAGE检验。粗纯化蛋白的最适反应pH为5.5，最适反应温度为55℃，在40℃到60℃时的热稳定性较高，大于60℃时酶活损失严重。根据漆酶的四个铜离子结合位点的保守性，设计简并性引物，RT-PCR得到滑菇漆酶cDNA片段。使用SMARTTM RACE cDNA Apmlification Kit得到完整的漆酶cDNA基因。漆酶cDNA长1733bp，编码区为1542bp,编码了514个氨基酸，前18个氨基酸是信号肽，并且有多种限制性内切酶的酶切位点。理论等电点为5.52，理论分子量为56952.90Da。使用Invitrogen的EasySelectTM Pichia Expression Kit对漆酶cDNA基因进行外源表达，载体为pPICZαB，宿主菌为KM71H（Muts，Aag+）。转化得到的阳性克隆分别采用活性平板培养和摇床诱导产酶培养检测，虽然多种验证证实滑菇漆酶基因已经整合到酵母基因组DNA中，但是无活性的漆酶产生说明表达还存在着复杂的问题。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1.前言
• 2.文献综述
• 2.1 木质素的研究概况
• 2.1.1 木质素
• 2.1.2 木质素的微生物降解
• 2.2 漆酶的研究现状
• 2.2.1 漆酶的结构和性质
• 2.2.2 漆酶的分子生物学
• 2.2.3 漆酶的诱导合成
• 2.2.4 不同培养条件对产酶的影响
• 2.2.5 漆酶的用途
• 2.3 基于简并PCR技术的基因克隆
• 2.3.1 简并性引物的设计
• 2.3.2 简并PCR的反应条件
• 2.3.3 简并PCR的应用
• 2.3.4 简并PCR的局限性
• 2.4 cDNA末端快速扩增技术（RACE）的研究进展
• 2.4.1 RACE技术的基本原理
• 2.4.2 RACE技术的优点与局限
• TM RACE cDNA Amplification Kit的原理'>2.4.3 SMART^TM RACE cDNA Amplification Kit的原理
• 3.滑菇漆酶的诱导产酶
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 菌种
• 3.1.2 原料及药品
• 3.1.3 器材
• 3.1.4 培养基
• 3.1.5 滑菇的培养方法
• 3.1.6 粗酶液的制备
• 3.1.7 漆酶酶活力的测定
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 四种不同培养基对滑菇漆酶产酶的影响
• 3.2.2 以D培养基为基础,研究不同碳氮源比例的四种培养基对漆酶产酶的影响
• 3.2.3 选择HCHN培养基,研究不同氮源对漆酶产酶的影响
• 3.2.4 金属离子对滑菇漆酶产酶的影响
• 3.3 小结
• 4.漆酶的粗分离提纯及酶学性质分析
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 原料及药品
• 4.1.3 器材
• 4.1.4 漆酶活力的测定
• 4.1.5 蛋白质含量的测定
• 4.1.6 分离纯化方法
• 4.1.7 酶学特性的初步研究
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 DEAE阴离子交换柱平衡pH条件的选择
• 4.2.2 蛋白质含量的测定
• 4.2.3 漆酶纯化分离结果
• 4.2.4 SDS-PAGE检测纯化效果
• 4.2.5 pH对漆酶活性的影响
• 4.2.6 温度对漆酶活性的影响
• 4.2.7 温度对漆酶热稳定性的影响
• 4.3 小结
• 5.滑菇漆酶cDNA基因的分子克隆
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 试剂盒
• 5.1.2 酶及试剂
• 5.1.3 仪器
• 5.1.4 培养基
• 5.1.5 菌丝的获取
• 5.1.6 滑菇总RNA的提取
• 5.1.7 mRNA质量的检测
• 5.1.8 滑菇漆酶cDNA片段的获得
• 5.1.9 RACE法获得滑菇漆酶cDNA的全长
• 5.2 结果与讨论
• 5.2.1 滑菇总RNA的提取
• 5.2.2 滑菇cDNA片段的获得
• 5.2.3 5’RACE扩增片段的克隆
• 5.3 小结
• 6.滑菇漆酶基因的外源表达
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 待表达的基因
• 6.1.2 试剂盒
• 6.1.3 酶
• 6.1.4 表达体系
• 6.1.5 培养基的配制
• 6.1.6 器材
• 6.1.7 为漆酶基因引入SfiI,NotI两酶切位点的引物的设计
• 6.1.8 PCR引入SfiI,NotI的酶切位点
• 6.1.9 SfiI,NotI分别酶切加入酶切位点的漆酶基因和质粒pPicZaB
• 6.1.10 表达载体的构建
• 6.1.11 表达载体电转化入Pichia Pastoris
• 6.1.12 生物反应筛选阳性克隆
• 6.1.13 培养筛选
• 6.1.14 含有漆酶基因的pPICZαB PCR验证
• 6.1.15 含有漆酶基因的pPICZαB双酶切验证
• 6.1.16 酵母DNA的提取,PCR验证
• 6.2 结果与讨论
• 6.2.1 质粒小提含漆酶基因的pGEM-TEasy Vector
• 6.2.2 含有SfiI,NotI酶切位点的基因的获得
• 6.2.3 SfiI,NotI酶切基因
• 6.2.4 SfiI,NotI酶切质粒pPICZαB
• 6.2.5 连接转化阳性克隆的筛选
• 6.2.6 表达质粒转化酵母KM71H
• 6.2.7 生物反应筛选转化得到的阳性克隆
• 6.2.8 摇瓶培养筛选电转化所得到的阳性克隆
• 6.2.9 含有漆酶基因的pPICZαB双酶切验证
• 6.2.10 验证漆酶基因是否重组到酵母细胞中
• 6.3 小结
• 7.总结
• 参考文献
• 详细摘要