论文摘要
一、实验目的:1、完成大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）的体外培养、传代,研究不同剂量的60Coγ射线对MSCs增殖的影响,观察5-aza能否诱导MSCs分化为心肌样细胞及射线对其分化能力的影响。2、建立大鼠急性心肌粳死（AMI）的模型,探讨MSCs移植治疗AMI的可行性,评价经照射和未照射处理的MSCs移植后对大鼠心梗后心脏形态、结构及功能的影响,并检测MSCs移植后其分泌的细胞因子（VEGF、bFGF、IL-1β）在心肌内表达的变化。3、研究体外培养的经不同剂量射线照射的MSCs分泌细胞因子（VEGF、bFGF、IL-1β）的变化,评价心肌内注射MSCs培养上清液,并定期给与腹腔内注射后,对大鼠心梗后心脏形态、结构及功能的影响,初步探讨其作用机制。二、实验方法:1、取冻存的第一代大鼠MSCs采用贴壁培养法进行细胞培养、传代,取第3代MSCs行60Coγ射线照射（剂量为2Gy、4Gy、8Gy、12Gy）,结晶紫染色观察生长情况和细胞形态。培养4周后行台盼蓝染色排斥试验观察MSCs的存活情况,MTT比色试验检测其增殖能力的变化。另取4Gy照射组及未照射组MSCs加入5-aza诱导分化4周,RT-PCR检测C-TNT、β-MHC的表达。2、50只大鼠随机分为心梗对照组、MSCs移植组、照射MSCs（4Gy）移植组,术前超声检查心功能,采用开胸冠状动脉结扎法建立AMI模型,心梗1h后分别注射两种MSCs,同步记录ECG变化。术后4周行超声和血流动力学检测心脏大小和心功能变化,RT-PCR检测VEGF、bFGF、IL-1β在心肌内的表达,心脏标本行HE染色,并行Ⅷ因子免疫组化染色比较不同组微血管密度的差异。3、收集各组MSCs照射前及照射后第一次换液的培养液,用ELISA法检测各组上清液中VEGF、IL-1β、bFGF含量的变化。4、30只大鼠随机分为注射上清液组和培养基组,除了采用RT-PCR和ELISE两种方法检测VEGF、bFGF、IL-1β在心肌组织内的表达外,其他实验步骤、方法及检测指标同实验第二部分。三、实验结果:1、未照射组、2Gy和4Gy组细胞生长良好,8Gy和12Gy组细胞全部死亡。2Gy组细胞增殖能力未受到影响,而4Gy组细胞增殖能力受到抑制,且持续3周以上。未照射组和4Gy照射组经5-aza诱导,4周后未发现心肌样细胞,未见细胞融合及肌管形成,但C-TNT和β-MHC在未照射组有所表达,而4Gy组无表达。2、第二部分大鼠心梗模型成功率74%,存活率66%。心脏超声各项指标（LVEF、LVDd、LVDs、FS）三组都明显低于术前,两细胞移植组较心梗对照组术后心功能明显改善、心脏缩小。两细胞移植组的各项血流动力学指标LVSP、LVEDP、+dp/dtmax、-dp/dtmin明显好于心梗对照组。两细胞移植组三种细胞因子表达明显增加,而对照组未检测到。Ⅷ因子免疫组化染色微血管计数对照组明显少于两细胞移植组。3、不同剂量照射后三种细胞因子表达同照射前相比都下降,且随着照射剂量的增加,细胞因子分泌量下降明显。4、第三部分心梗模型成功率83.3%,存活率73.3%。超声和血流动力学检测上清液组各项指标明显好于培养基组。上清液组检测心肌组织三种细胞因子表达增加,ELISA法能检测到培养基组和心梗对照组三种细胞因子少量表达。Ⅷ因子免疫组化染色微血管计数值上清液组显著高于培养基组。四、实验结论:1、体外培养的MSCs对60Coγ射线比较敏感,辐射剂量达到一定程度（4Gy）后会影响MSCs的活力和增殖能力,表现为其活力和增殖能力明显受到抑制,8Gy以上大剂量照射后导致MSCs全部死亡。小剂量的60Coγ射线（4Gy）照射会抑制或损伤大鼠MSCs的分化能力,可能是损伤或者暂时抑制这种能力。2、移植丧失分化能力的MSCs及正常MSCs都能明显改善心梗后早期的心功能。MSCs移植后在心肌内能表达多种细胞因子如（VEGF、bFGF和IL-1β）,单独注射这些细胞因子同样能够改善心功能,可见MSCs移植能够改善心梗后早期的心功能,MSCs的旁分泌效应起到了主要作用。旁分泌的作用机制很复杂,促新生血管形成是其中重要的环节。3、体外培养的MSCs能分泌多种细胞因子,60Coγ射线照射能影响MSCs的旁分泌功能。随着照射剂量的增加,细胞因子分泌量下降明显。
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