甘蓝型油菜再生体系与农杆菌介导的甜菜碱合成基因遗传转化研究

论文题目: 甘蓝型油菜再生体系与农杆菌介导的甜菜碱合成基因遗传转化研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 植物病理学

作者: 韩德俊

导师: 李振岐

关键词: 油菜,花茎培养,再生,幼胚培养,遗传转化,甜菜碱醛脱氢酶,胆碱氧化酶,原位转化

文献来源: 西北农林科技大学

发表年度: 2005

论文摘要: 十字花科（Cruifrae）芸薹属（Brassica genus）包含了一些重要的油料作物和蔬菜作物,其中有6个物种被广泛种植。甘蓝型油菜（Brassica.napus L.）是全球继大豆和棕榈油之后第三大油料作物。随着人类需求的增加和新科技手段的不断涌现,油菜品种改良正呈多元化发展,植物转基因技术在油菜遗传改良中广泛应用,推动了油菜遗传育种工程技术进行一次新的革命。转基因技术已经成为向油菜导入新型外源基因的重要手段,转基因抗除草剂油菜、抗虫油菜、高油脂含量油菜、油菜新型不育系等已大规模投入商业化生产,抗病、抗环境逆境胁迫（干旱、盐碱、高温和低温）等新型油菜育种材料的创制已成为重要研究课题。 本研究主要目标是,立足西北地区油菜品种,筛选最佳转化受体,建立农杆菌介导的油菜高效转化体系,获得CMO和BADH抗盐耐旱基因的油菜转化体,为利用基因工程改良油菜奠定基础。 研究了甘蓝型油菜花茎外植体高效诱导不定芽的再生体系,结果表明:以含有2,4-D（0.5～1.0mg/L）的培养基对外植体进行预培养,以及在分化培养基中加入AgNO3（2～6mg/L）,可显著降低外植体褐化坏死的频率,提高了不定芽的发生频率及其再生能力;6BA（2.5mg/L）与NAA（0.1mg/L）配合使用有利于提高不定芽发生频率;再生的不定芽90%可长根。 研究了油菜未成熟胚胎离体培养条件下的几种再生方式。结果表明,油菜幼胚离体培养以三种方式实现再生:①幼胚早熟萌发,在茎顶端分生组织区依次产生多个额外子叶,表明幼胚外植体仍保持着胚性发育特点;②子叶近轴端和下胚轴表面直接产生类胚结构,继代后部分类胚结构可发育成体细胞胚,其它则由于无茎顶端分生组织,最终不能形成完整植株;③外植体细胞脱分化形成愈伤组织,继代后胚性愈伤组织产生单生的体细胞胚,最终可发育成完整的小植株。2,4—D是影响外植体再生方式的重要因素,它抑制了幼胚早熟萌发。在无2,4—D的培养基上,幼胚早熟萌发,主要以第一种方式实现再生;在2,4—D诱导下,外植体主要以第二或第三种方式再生。不同基因型间在外植体再生方式和体胚诱导率上存在差异。 以30个甘蓝型油菜品种（系）的子叶和下胚轴为外植体,研究了子叶和下胚轴的再生能力和再生方式,以及在抗菌素（羧苄青霉素和头孢霉素）和筛选剂（卡那霉素）胁迫下,各基因型子叶和下胚轴外植体的再生能力。结果表明,油菜子叶和下胚轴外植体主

论文目录:

摘要

ABSTRACT

第一章 文献综述

1.1 植物离体组织和细胞再生的研究进展

1.1.1 植物细胞全能性

1.1.2 植物细胞决定作用

1.1.3 植物细胞分化

1.1.4 植物细胞脱分化

1.1.5 再分化

1.1.6 离体组织器官发生

1.1.7 体细胞胚胎发生

1.2 农杆菌介导的植物遗传转化研究进展

1.2.1 农杆菌及 Ti质粒生物学特性

1.2.2 农杆菌转化系统的优点

1.2.3 农杆菌转化植物的分子机制

1.2.4 T- DNA整合的分子机制

1.2.5 植物对于农杆菌侵染的抗性

1.2.6 影响农杆菌转化效率的因素

1.3 甜菜碱合成基因工程

1.3.1 甜菜碱的生物合成

1.3.2 与甜菜碱合成有关的酶及其编码基因

1.3.3 甜菜碱合成基因工程

1.4 油菜转基因育种研究进展

1.4.1 建立高效转化体系的影响因素

1.4.2 应用于油菜等芸苔属植物性状改良的基因转化

1.4.3 油菜遗传转化中存在问题及展望

1.5 研究目的和意义

第二章 甘蓝型油菜花茎高效再生体系研究

2.1 材料和方法

2.1.1 试验材料

2.1.2 试验方法

2.2 结果与分析

2.2.1 预培养对外植体分化的促进作用

2.2.2 激素配比对不定芽诱导的影响

2.2.3 AgNO_3对花茎离体再生能力影响

2.3 讨论

第三章 甘蓝型油菜幼胚培养与体细胞胚胎发生研究

3.1 材料与方法

3.1.1 植物材料

3.1.2 离体培养

3.2 结果与分析

3.2.1 不同发育时期的油菜胚胎在离体条件下的胚后发育模式

3.2.2 愈伤组织形成

3.2.3 体细胞胚胎发生

3.3 讨论

第四章 甘蓝型油菜子叶和下胚轴再生体系研究

4.1 材料与方法

4.1.1 试验材料

4.1.2 培养基

4.1.3 无菌实生苗的建立和外植体培养

4.1.4 子叶和下胚轴外植体对抑菌剂的敏感性实验

4.1.5 子叶和下胚轴外植体对 Km浓度敏感性试验

4.2 结果与分析

4.2.1 子叶和下胚轴外植体的再生方式

4.2.2 不同基因型间子叶和下胚轴再生能力的差异

4.2.3 抑菌剂胁迫下油菜子叶和下胚轴外植体的再生能力

4.2.4 卡那霉素对油菜子叶和下胚轴外植体芽再生能力的影响

4.3 讨论

第五章 农杆菌介导的油菜子叶和下胚轴的遗传转化研究

5.1 材料与方法

5.1.1 植物材料

5.1.2 质粒与农杆菌菌株

5.1.3 培养基

5.1.4 农杆菌活化与培养

5.1.5 植物外植体培养

5.1.6 共培养

5.1.7 转化细胞筛选与再生

5.1.8 转化体生根

5.1.9 转化体 PCR鉴定

5.1.10 转基因植株 BADH活性分析

5.2 结果与分析

5.2.1 转化体的获得

5.2.2 外植体对农杆菌侵染的反应与再生

5.2.3 共培养方式对外植体再生的影响

5.2.4 AgNO_3对外植体再生的影响

5.2.5 转基因植株的获得与PCR检测

5.2.6 BADH酶活性鉴定

5.2.7 CMO转化体的获得与耐盐性评价

5.3 讨论

第六章 农杆菌介导油菜IN PLANTA整体转化体系的研究

6.1 材料与方法

6.1.1 植物材料

6.1.2 质粒

6.1.3 农杆菌转化

6.1.4 In planta转化油菜

6.1.5 GUS基因活性瞬时表达鉴定

6.1.6 抗生素抗性筛选

6.1.7 GUS基因 PCR鉴定

6.1.8 BADH基因PCR检测分析

6.1.9 CMO基因转化体抗盐能力评价

6.1.10 试剂

6.2 结果与分析

6.2.1 工程菌的鉴定

6.2.2 油菜的花器结构和开花特点

6.2.3 农杆菌蘸花侵染对油菜结实的影响

6.2.4 GUS基因瞬时表达鉴定

6.2.5 卡那霉素抗性和潮霉素抗性系的筛选

6.2.6 转化体鉴定

6.3 讨论

6.3.1 In planta转化法对油菜的有效性

6.3.2 转化的最佳时期

结论

参考文献

致谢

作者简介

发布时间: 2007-04-06

参考文献

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