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复杂蛋白质样品中目标组分柱层析分离纯化策略研究

2020-12-08阅读(789)

复杂蛋白质样品中目标组分柱层析分离纯化策略研究

论文摘要

本论文将复杂蛋白质混合样品中目标蛋白的分离纯化抽象为双组分和三组分混合蛋白样品的分离纯化过程,以双组分和三组分蛋白质混合物中目标蛋白的离子交换柱层析分离纯化过程为研究对象,探讨了目标蛋白在层析柱上的分离纯化策略,并以从猪全血中分离纯化高纯度猪血红蛋白和从戊二醛聚合猪血红蛋白中去除低分子量血红蛋白的分离纯化策略为例,验证了本文提出的分离纯化策略,为中试和规模化分离纯化目标蛋白提供了高效和可行的解决方案。在双组分混合样品的分离纯化策略研究中,以猪血红蛋白和溶菌酶在CM SepharoseFast-Flow阳离子交换层析上的分离纯化过程为例,研究了它们的分离纯化策略。对于图谱类型Ⅰ,主要根据层析介质有效柱容量采用流穿模式进行洗脱,使少量蛋白达到浓缩富集的目的。对于图谱类型Ⅱ,主要采用吸附模式进行步级梯度洗脱方式进行:在三组分混合样品的分离纯化策略研究中,以猪血红蛋白、溶菌酶和胰蛋白酶在SP SepharoseFast-Flow强阳离子交换层析上的分离纯化过程为例,研究了它们的分离纯化策略。对三组分混合物的分离纯化过程,可以归纳为三种分离纯化策略:纯化策略Ⅰ:采用一步流穿模式纯化;纯化策略Ⅱ:采用步级梯度洗脱纯化;纯化策略Ⅲ:采用两步流穿模式纯化。采用以上分离纯化策略得到的猪血红蛋白和溶菌酶经凝胶排阻高效液相色谱（SEC-HPLC）检测纯度均达到99.9%以上,离子交换高效液相色谱（IEX-HPLC）检测纯度均达到95%以上,回收率都在93%以上,且目标产物均可不同程度的浓缩。通过经济效益分析,新的纯化策略比传统纯化策略产量均高出10倍以上,缩短了单次纯化时间并扩大了单位时间的产量。在从猪全血中纯化高纯度猪血红蛋白的分离纯化策略研究中,通过对缓冲体系种类、缓冲体系pH值、盐离子强度、动态柱容量等条件的优化,以及对比吸附模式和流穿模式分离纯化结果的分析,最终选择DEAE Sepharose Fast-Flow阴离子交换层析介质为固定相,以20.0 mmol/L磷酸缓冲液+0.16 mol/L NaCl（pH8.0）上样流穿洗脱至杂质饱和层析柱后,再以20.0 mmol/L磷酸缓冲液+1.0 mol/L NaCl（pH8.0）洗脱杂质。纯化后的Hb经TSK-GEL G3000SWXL检测纯度99.99%,Shim-Pack WAX-1检测纯度为97.86%,SDS-PAGE检测达到电泳纯,并未检测出磷脂酰丝氨酸和磷脂酰乙醇胺,全部指标均达到美国FDA对基于血红蛋白的红细胞代用品的原料质量标准。在从戊二醛聚合猪血红蛋白中去除低分子量血红蛋白的分离纯化策略研究中,分别对它们在Sephadex G-75凝胶排阻层析、排阻限为10 kD的中空纤维柱超滤和DEAESepharose Fast-Flow阴离子交换层析三种纯化方法上的工艺路线进行了对比,最终选择了DEAE Sepharose Fast-Flow阴离子交换层析。优化后的层析分离纯化条件为:以20.0mmol/L PB+0.06 mol/L NaCl（pH7.3）作为平衡缓冲液,以NaCl溶液进行线性梯度洗脱,最后再以20.0 mmol/L PB+1.0 tool/L NaCl（pH7.3）进行洗脱。纯化后的聚合体血红蛋白经凝胶排阻色谱和多角度激光散射仪联用检测64 kD以下分子量血红蛋白含量小于5%,符合本实验室质量控制标准。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第一章 文献综述
  • 1. 蛋白质分离与纯化的一般原则
  • 2. 蛋白质分离纯化的色谱技术
  • 2.1 凝胶排阻色谱
  • 2.2 疏水作用层析
  • 2.4 金属偶联色谱
  • 2.5 共价作用色谱
  • 2.6 等电聚焦层析
  • 3. 离子交换色谱
  • 3.1 工作原理
  • 3.2 影响保留的因素
  • 3.3 离子交换色谱分离小分子溶质与生物大分子的差别
  • 3.4 离子交换层析条件的选择
  • 4. 红细胞代用品研究
  • 4.1 红细胞代用品研究概况
  • 4.2 血红蛋白的提取、分离与纯化的研究状况
  • 4.2.1 全血中血红蛋白的提取和分离
  • 4.2.2 超高纯度血红蛋白的纯化
  • 4.3 血红蛋白修饰产物的分离纯化
  • 5. 本文研究内容、目的和创新点
  • 第二章 双组分及三组分混合物在离子交换层析中的分离纯化策略
  • 1. 引言
  • 2. 蛋白在离子交换层析上的分离纯化策略
  • 2.1 离子交换层析纯化蛋白质需考虑的五个方面
  • 2.2 离子交换层析中蛋白质洗脱曲线的突跃区
  • 2.3 双组分及三组分混合物中目标蛋白在离子交换层析上纯化模式
  • 2.3.1 双组分混合物分离纯化模式
  • 2.3.2 三组分混合物分离纯化策略
  • 3. 实验设计
  • 3.1 实验材料
  • 3.1.1 实验试剂
  • 3.1.2 仪器设备
  • 3.2 双组分蛋白混合物离子交换柱层析实验设计
  • 3.2.1 溶菌酶的分离纯化及浓缩
  • 3.2.2 猪血红蛋白的分离纯化
  • 3.3 三组分蛋白混合物离子交换柱层析实验设计
  • 3.3.1 纯化策略Ⅰ实验设计
  • 3.3.2 纯化策略Ⅱ实验设计
  • 3.3.3 纯化策略Ⅲ实验设计
  • 3.4 蛋白质检测分析方法
  • 3.4.1 高效液相色谱法检测
  • 3.4.2 紫外（UV）吸收法测定蛋白质浓度
  • 4. 结果与分析
  • 4.1 双组分蛋白混合物离子交换柱层析
  • 4.1.1 溶菌酶的分离纯化及浓缩
  • 4.1.2 猪血红蛋白的分离纯化
  • 4.2 三组分蛋白混合物离子交换柱层析实验设计
  • 4.2.1 纯化策略Ⅰ实验设计
  • 4.2.2 纯化策略Ⅱ实验设计
  • 4.2.3 纯化策略Ⅲ实验设计
  • 5. 本章小结
  • 第三章 猪全血中分离纯化高纯度猪血红蛋白的工艺
  • 1. 引言
  • 2. 实验材料
  • 2.1 实验试剂
  • 2.2 仪器设备
  • 3. 实验方法
  • 3.1 猪血蛋白粗品制备
  • 3.1.1 猪血红细胞的洗涤和血红蛋白的释放
  • 3.1.2 超滤
  • 3.2 层析柱处理
  • 3.3 阴离子交换层析 pH值的选择
  • 3.4 阴离子交换层析缓冲体系的选择
  • 3.5 阴离子交换层析离子强度的选择
  • 3.6 穿透曲线和动态柱容量的测定
  • 3.7 工艺路线的选择和优化
  • 3.8 分析检测
  • 3.8.1 SDS-PAGE凝胶电泳
  • 3.8.2 猪血红蛋白纯度检测
  • 3.8.3 血红蛋白浓度及高铁血红蛋白含量测定
  • 3.8.4 磷脂含量测定
  • 4. 结果与分析
  • 4.1 血红蛋白的释放和粗纯
  • 4.2 缓冲液 pH值的选择
  • 4.2.1 pH值对血红蛋白分离的影响
  • 4.2.2 pH值对高铁血红蛋白生成的影响
  • 4.3 阴离子交换层析缓冲体系的选择
  • 4.4 缓冲液离子强度的选择
  • 4.4.1 离子强度对血红蛋白分离的影响
  • 4.4.2 离子强度对高铁血红蛋白生成的影响
  • 4.5 穿透曲线和有效柱容量测定
  • 4.6 磷酸盐缓冲体系中盐浓度与电导值关系的建立
  • 4.7 最适流穿浓度选择
  • 4.8 阴离子交换介质动态吸附容量测定
  • 4.9 工艺选择
  • 4.10 分析检测试验结果
  • 4.10.1 SDS-PAGE电泳
  • 4.10.2 高效液相色谱分析
  • 4.10.3 磷脂检测
  • 5. 本章小结
  • 第四章 戊二醛聚合猪血红蛋白的制备及纯化
  • 1. 引言
  • 2. 实验材料
  • 2.1 实验试剂
  • 2.2 仪器设备
  • 3. 实验方法
  • 3.1 猪血红蛋白的制备
  • 3.2 戊二醛聚合猪血红蛋白的制备
  • 3.3 戊二醛聚合猪血红蛋白的纯化
  • 3.3.1 工艺路线A
  • 3.3.2 工艺路线B
  • 3.3.3 工艺路线C
  • 3.4 戊二醛聚合猪血红蛋白分子量的测定
  • 4. 结果与分析
  • 4.1 工艺研究结果与讨论
  • 4.1.1 戊二醛聚合猪血红蛋白的分子量分布
  • 4.1.2 工艺路线A实验结果
  • 4.1.3 工艺路线B实验结果
  • 4.1.4 工艺路线C实验结果
  • 4.2 工艺选择
  • 4.3 工艺优化
  • 5. 本章小结
  • 第五章 结论与展望
  • 1. 主要结论
  • 2. 展望
  • 致谢
  • 参考文献

    • 相关论文文献

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