TNF-α拮抗剂—依那西普治疗RA及下调Th1/2/17细胞亚群的研究

论文摘要

【背景】类风湿关节炎（rheumatoid arthritis, RA）是以慢性多关节滑膜炎为主要特征的全身性自身免疫病,也是致残的主要疾病之一。目前发病机制未明,一般认为RA患者疾病的发生、发展在一定程度上与T淋巴细胞免疫功能紊乱、CD4+T辅助细胞（T help subset cell, Th）亚群失衡密切相关。关于Thl和Th2失衡的研究颇多,然而对于最近研究发现的Th17细胞亚群尚知之甚少。鉴于此群细胞以分泌白介素（interleukin,IL）-17为特征,结合既往发现RA滑膜和滑液中存在Th17细胞,并有IL-17的高水平表达以及体内、外实验证明IL-17可刺激滑膜细胞等释放肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor, TNF-α）、IL-6等炎症介质,提出此Th17可能在RA发生和发展中占主导作用。近10年来,生物制剂的研究和应用不仅成为RA治疗的一大亮点,而且由于其治疗效果确切、副作用小,因此在制剂的种类和应用的范围均发展迅速,使得RA的生物治疗引领了二十一世纪生物治疗的新潮流。尽管对生物制剂的应用有着日新月异的发展,但对其在RA治疗中的机制尚知之甚少,亟待深入的研究和探讨。【目的】鉴于TNF-α具有促进IL-2、CSF和INF-γ等细胞因子的产生,促进高亲和力IL-2受体的表达,促进T细胞活化的生物活性,本课题旨在:1.研究活动期RA患者外周血中Th1、Th2、Th17数量的变化,及其与疾病活动程度的相关性,探讨Th细胞参与RA发生发展的作用; 2.测定肿瘤坏死因子拮抗剂——依那西普治疗前及治疗12周,RA患者Th1、Th2和Th17数量和比例的变化,研究TNF-α及依那西普治疗对T细胞亚群的作用;3.研究Th1、Th2和Th17的消长与RA患者病情活动的相关性,从而为阐明TNF-α在RA发病中的作用及依那西普治疗RA的机制提供线索和研究体系。【方法】分三大部分:1.以20例活动期RA患者为观察对象,以10例健康献血员作为对照。采用细胞表面标志和细胞内细胞因子双重和三重免疫荧光标记、流式细胞术（FCM）和酶联免疫吸附试验（ELISA）测定并分析Th1、Th2、Th17细胞在RA患者外周血单个核细胞（PBMC）中的数量、比例和相应细胞因子的表达状况及其与病情活动指数（DAS28）和CRP等的相关性;2.采用ELISA和FCM分别测定并研究比较依那西普联合MTX治疗组和MTX对照组治疗前及治疗12周Th1、Th2、Th17细胞在RA患者外周血中的数量、比例和相应细胞因子的表达状况;3.RA患者病情活动性及疗效评价指标变化及相关性分析观察上述两组RA患者治疗前及治疗12周各指标的变化。记录晨僵时间、健康评估问卷（HAQ）平均分,计数压痛及肿胀关节数,计算疾病活动指数（DAS28）;免疫比浊法测C反应蛋白（CRP）;魏氏法测血沉（ESR）;ELISA法测抗环瓜氨酸（CCP）抗体和类风湿因子（RF）亚型。并用spersman分析上述不同组RA患者外周血中Th细胞亚群的变化幅度和病情活动的相关性。【结果】1.Th细胞亚群（Th1/ Th2/Th17）的表达活动期RA患者PBMC中CD4+IFN-γ+Th1百分率显著高于正常对照组（27.0±2.9 vs 22.5±2.1, P<0.05）,而CD4+IL-4+Th2细胞阳性率及平均荧光强度（MFI）与正常对照的差异无统计学意义（P>0.05）;活动期RA患者CD4+IL-17+Th17细胞阳性率及MFI显著高于正常对照（36.8±2.6%, 26.6±2.6 vs 3.57±0.6%, 11.4±1.9,P<0.01）。Th1/Th2比值（12.7±1.6）也高于正常对照（8.7±1.9, P<0.05）。活动期RA患者PBMC培养上清中IFN-γ、IL-4水平与健康对照相比差异均无统计学意义,但IL-17水平明显高于健康对照组[（40±3.8）ng/L vs （30±2.0）ng/L, P<0.05]。RA患者外周血中Th17百分率与CRP、DAS28呈正相关（P<0.05,r=0.36; P<0.05,r=0.40）。2. TNF-α拮抗剂—依那西普对Th细胞亚群的作用依那西普联用MTX治疗组患者CD4+IFN-γ+Th1细胞阳性率治疗前高于治疗后,但MFI治疗前后差异无统计学意义;CD4+IL-4+Th2细胞阳性率和MFI治疗前后差异亦无统计学意义。Th1/Th2比值治疗后也下降;CD4+IL-17+Th17细胞阳性率及MFI治疗前均明显高于治疗后及健康对照组。而MTX组治疗前后各细胞亚群变化的差异无统计学意义。联用组治疗后IL-17水平显著低于治疗前（28±2.6pg/mL vs 40±3.8pg/mL, P<0.05）,联用组治疗后的IL-17水平下降幅度显著大于MTX对照组（P<0.05）。3. RA患者治疗前后病情变化依那西普联用MTX治疗组患者治疗后休息痛、晨僵时间、压痛关节数、肿胀关节数、CRP、RF-IgA、RF-IgM和DAS28均明显降低,ESR治疗后亦下降;但HAQ平均分、RF-IgG、抗CCP抗体治疗前后比较差异无统计学意义。MTX对照组治疗后DAS28明显下降,RF-IgA和RF-IgM治疗后亦下降。4.相关性分析对20例RA患者Th1/Th2及Th17细胞阳性率变化幅度与CRP、RF亚型、抗CCP抗体水平和DAS28的进行相关性分析。结果表明, MTX和依那西普联用组患者的Th17细胞阳性率与患者CRP、DAS28水平呈正相关,与患者的RF亚型、抗CCP抗体水平相关性无统计学意义（P>0.05）,Th1/Th2比值和上述临床指标相关性亦无统计学意义（P>0.05）。【结论】1、活动期RA患者外周血CD4+IL-17+Th17细胞明显高于正常对照,且与病情活动程度正相关,提示Th17可能与RA的发病和发展有关,可能是RA发生和发展的一个重要因素。2、两组患者在治疗12周后,DAS28较治疗前降低或明显降低（MTX单用组P<0.05,联用组P<0.01）,且联用组患者的休息痛、晨僵时间亦有改善（P<0.05）,CRP明显下降（P<0.01）。但两组患者的HAQ平均分治疗前后的差异无统计学意义。联用组DAS28、休息痛、晨僵时间、CRP的改善幅度均高于MTX组,其疗效明显优于MTX组,差异有统计学意义（P<0.05）。3、接受依那西普联合MTX治疗的RA患者其外周血中Th17的降低多于MTX单用组的患者,说明依那西普可下调Th17;另外,依那西普联合MTX治疗的RA患者外周血Th17细胞的变化幅度与患者疾病活动程度呈正相关,进一步证实依那西普可以通过下调Th17来改善患者的病情,达到治疗自身免疫病的目的。4、所建立的Th细胞亚群尤其是Th17的研究体系和方法,为进一步研究Th17在RA发病中的作用提供了工作基础和条件。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾
• 第一部分 T细胞在类风湿关节炎发病中的作用研究进展
• 第二部分 TNF-α在类风湿关节炎发病中的作用研究进展
• 第三部分 抗TNF-α治疗的研究进展
• 正文
• 实验一 RA 患者外周血中 Th1/2/17 细胞的变化
• 1. 材料
• 2. 方法
• 3. 结果
• 4. 讨论
• 实验二 依那西普治疗对RA患者Th1/2/17细胞的作用
• 1. 材料
• 2. 方法
• 3. 结果
• 4. 讨论
• 实验三 依那西普治疗RA的效果与Th1/2/17细胞变化的相关性分析
• 1. 方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 小结
• 参考文献
• 个人简历和研究成果
• 致谢