论文摘要
脊髓损伤（SCI）是危害人类健康的严重疾病,随着社会经济的发展,发病率增长明显。SCI功能缺失主要是由于脊髓神经元轴突和神经元的靶联系信息中断及SCI诱发神经元病理性死亡及凋亡引起的。保护神经元、促进轴突再生是改善SCI病人预后功能的关键。SCI中的继发性损伤由于具有可逆性和可调控性成为研究的重点,然而继发性损伤的机制繁多,作用复杂,研究起来十分困难,其中氧化应激由于作用明确,且与很多机制相联系,成为目前研究的一个热点。中枢神经系统损伤存在炎症反应,并且SCI中的炎症反应比创伤性脑损伤的炎症反应更明显。炎症反应一方面可以加重中枢神经系统损伤,另一方面又促进损伤的修复。核因子E2 p45相关因子2 （Nrf2）是一种新发现的转录因子,在多种刺激作下,Nrf2可以和细胞核内的抗氧化反应元件（ARE）结合,启动抗氧化元件调控的一系列保护性分子的表达。近来的一些研究发现,Nrf2/ARE通路在调控炎症免疫反应中发挥重要作用,可能是天然免疫反应和机体存活的关键调控因子。结合临床实际,我们提出:SCI的炎症反应可能激活Nrf2/ARE抗氧化机制,适量的炎症反应可能有助于保护神经元细胞,改善SCI的预后功能,而其中Nrf2/ARE抗氧化机制可能发挥重要作用。本研究拟以低剂量LPS刺激PC12细胞,建立体外神经元细胞炎症刺激模型,探讨低剂量LPS对PC12细胞Nrf2/ARE通路的影响,以及对PC12细胞再灌注损伤的保护的作用;构建Nrf2重组腺病毒载体,一方面通过体外实验研究Nrf2过表达对PC12细胞增殖影响以及保护作用,另一方面构建大鼠SCI模型,通过体内实验研究Nrf2重组腺病毒转染对神经元Nrf2/ARE抗氧化机制,以及对神经细胞凋亡,大鼠预后功能的影响。研究内容包括以下三部分:第一部分:低剂量LPS对PC12细胞中Nrf2/ARE抗氧化机制的影响及其在再灌注损伤的保护作用研究目的:探讨低剂量LPS对PC12细胞内Nrf2及其下游调控因子HO-1、NQO1、γ-GCS的影响,并研究Nrf2/ARE抗氧化机制在低剂量LPS预处理PC12细胞再灌注损伤保护中的作用。方法:用MTT法确立LPS的安全剂量。采用荧光定量PCR、Western-blot、免疫荧光检测低剂量LPS对PC12细胞内Nrf2 mRNA、总Nrf2蛋白表达及其在细胞质、细胞核分布的影响,并用Western-blot检测HO-1、NQO1、γ-GCS的表达。建立PC12细胞再灌注损伤模型,采用Hoechst33258染色检测低剂量LPS缺血缺氧期预处理再灌注24h的细胞凋亡情况;流式细胞仪检测缺血缺氧末及再灌注6h细胞的ROS;酶法检测LDH释放率;Western-blot检测缺血缺氧末细胞核Nrf2及细胞HO-1、NQO1、γ-GCS的表达。结果:不大于0.1μg/μl的LPS对PC12细胞是安全的（P>0.05）。用0.1μg/μl LPS处理PC12细胞,Nrf2 mRNA、总Nrf2蛋白表达6h开始升高（P<0.05）,24h达峰值（P<0.01）;细胞质Nrf2蛋白表达1h开始降低（P<0.01）,同时细胞核Nrf2蛋白开始升高（P<0.05）;免疫荧光显示细胞核内的Nrf2蛋白3h比1h表达明显;细胞内HO-1、NQO1、γ-GCS表达相应升高,峰值均在24h。在PC12细胞再灌注损伤模型中发现,再灌注24h,低剂量LPS预处理组细胞凋亡数明显减少,以0.05μg/μl LPS组最为明显（与未加LPS组比较P<0.05）,LDH的释放率相应降低。缺血缺氧末测得的细胞内ROS表达随LPS剂量增加而增加,再灌注6h,ROS出现随LPS剂量增加先降低后升高趋势,其中0.025μg/μl LPS组降低最为明显（与未加LPS组比较P<0.05）;缺血缺氧末细胞核Nrf2及细胞HO-1、NQO1、γ-GCS表达均增高,其中以0.05μg/μl LPS组最为明显。结论:低剂量的LPS能够促进PC12细胞内Nrf2的转录、翻译,以及从细胞质到细胞核的转移,激活Nrf2/ARE抗氧化机制;低剂量LPS预处理PC12细胞有助于细胞抵抗再灌注损伤,而其中Nrf2/ARE抗氧化机制可能发挥了重要作用。第二部分:Nrf2重组腺病毒构建及其对PC12细胞的影响目的:构建Nrf2重组腺病毒载体,并观察检测其对PC12细胞的影响。方法:将腺病毒穿梭质粒pAV-MCMV-GFP-Nrf2与腺病毒辅助包装质粒pBHG loxΔE1,3 Cre共转染HEK293细胞,得到Nrf2重组腺病毒,RT-PCR鉴定目的基因的表达,并进行扩增、纯化及滴度鉴定。用重组腺病毒转染PC12细胞,Western-blot检测PC12细胞中Nrf2、HO-1、NQO1、γ-GCS的表达;显微镜下观察Nrf2重组腺病毒对PC12细胞增殖的影响及对LPS的抵抗能力;流式细胞仪检测Nrf2过表达对PC12细胞生长周期的影响;Western-blot检测LPS刺激下IL-1β、Caspase-3的表达变化。结果:Nrf2重组腺病毒构建成功,PCR结果显示与穿梭质粒pAV-MCMV-GFP-Nrf2目的基因一致,扩增纯化可以得到7.9×1010pfu/ml病毒悬液。将Nrf2重组腺病毒转染PC12细胞,发现其能促进PC12细胞中Nrf2（细胞质/细胞核）、HO-1、NQO1、γ-GCS的表达,并抑制PC12细胞增殖,抵抗LPS的毒性损伤作用,降低IL-1β、Caspase-3的表达。结论:成功构建Nrf2重组腺病毒;Nrf2重组腺病毒转染能促进PC12细胞Nrf2/ARE抗氧化因子的表达,抑制细胞增殖,增强PC12细胞抗凋亡/坏死及抗炎能力。第三部分:Nrf2对脊髓损伤大鼠脊髓神经元的保护作用目的:观察检测Nrf2过表达对脊髓损伤大鼠脊髓神经元的保护作用方法:将160只SD大鼠随机分为4组:A组（假手术组）,B组（SCI组）,C组（Ad-Nrf2组）,D组（Ad-GFP组）,建立动物模型。观察术后大鼠的运动功能,并行BBB评分;大体观察脊髓标本,冰冻切片荧光显微镜下观察腺病毒的转染情况;组织切片HE染色,观察大鼠脊髓组织的形态学变化,水肿、炎症反应情况;免疫组化法检测组织切片中Nrf2、HO-1、NQO1、γ-GCS表达;TUNEL法检测组织切片中神经细胞的凋亡;免疫组化法检测组织切片中GAP-43的表达。结果: C组大鼠术后2w开始运动功能有明显改善（与B、D组比较P<0.05）。大体观察发现,术后4w C组脊髓保留相对较好。冰冻切片荧光显微镜下观察发现术后1d C组既有较强的绿色荧光表达,主要分布在注射阶段,术后3d,绿色荧光表达最强,损伤区荧光明显,之后绿色荧光表达逐渐减弱,术后4w仍可见少量绿色荧光表达。HE显示术后2w、4w C组脊髓炎性反应较轻,神经元保留较多。免疫组化发现C组损伤脊髓中Nrf2、HO-1、NQO1、γ-GCS表达阳性细胞数增多,着色较深,术后3d达峰值（与B、D组比较P<0.01）; GAP-43表达阳性细胞增多,7d达峰值（与B、D组比较P<0.01）。TUNEL法检测显示,细胞凋亡7d达峰值,C组损伤区凋亡细胞明显减少（与B、D组比较P<0.01）。结论:Nrf2重组腺病毒在脊髓损伤大鼠脊髓局部注射,能够促进大鼠脊髓损伤局部Nrf2/ARE通路介导的抗氧化因子表达,降低损伤局部的细胞凋亡和炎症反应,保护神经元,促进轴突再生,促进运动功能的恢复。
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