论文摘要
本研究旨在利用DNA重组技术将抗肿瘤血管生成的内皮抑素基因endostatin、抗肿瘤人脆性组氨酸三联体（FHIT）基因、绿色荧光蛋白EGFP基因及核糖体进入序列IRES构建真核多顺反子表达载体，研究这三个基因在Hela细胞中的表达。为此，首先根据endostatin基因mRNA序列设计引物，以人肝总RNA通过RT-PCR合成endostatin基因的cDNA序列，并将其克隆到pMD19-T中，利用XbaI和SalI限制性内切酶切割pMD19-T-es，将回收到的目的片段连接到载体pEF1-4SX中，构建成中间载体pEF1-es。用XbaI和HpaI限制性内切酶将中间载体pEF1-es中endostatin序列和IRES序列一同酶切回收，将回收片段连入表达载体pIRES2-EGFP-FHIT中，这样就构建了含有endostatin、FHIT和EGFP的三顺反子真核表达载体pES-IRES-FHIT-IRES-EGFP。将此表达载体用脂质体法转染Hela细胞，24h后在荧光显微镜下可观察到绿色荧光，用G418筛选出稳定转染的细胞，提取细胞的总RNA，分别用P1和P2，P3和P4，P5和P6，P1和P4进行RT-PCR鉴定，分别扩增出三个单顺反子和三顺反子DNA片段，用endostatin和FHIT探针对单顺反子和三顺反子RT-PCR产物做southern blot分析，得到预期杂交信号条带，证明单顺反子和三顺反子在RNA水平都得到表达。同时用endostatin探针进行northem blot分析，进一步证明三顺反子在RNA水平得到表达。在蛋白表达水平上，分别利用兔抗人FHIT抗体和兔抗人Endostatin抗体做免疫细胞化学分析，DAB显色后观察细胞被染成棕褐色，说明Endostatin、FHIT和EGFP在Hela细胞中均得到表达。本研究为基因药物和肿瘤多基因治疗提供实验依据，具有重要的理论意义。