论文题目: 中国明对虾免疫等相关基因的克隆、重组表达与功能分析
论文类型: 博士论文
论文专业: 海洋生物学
作者: 张继泉
导师: 相建海
关键词: 中国明对虾,蜕皮抑制激素,铁蛋白,重组表达,毕赤酵母,表达分析
文献来源: 中国科学院研究生院（海洋研究所）
发表年度: 2005
论文摘要: 本论文以中国明对虾为研究对象,采用分子克隆和体外重组表达技术,对部分与中国明对虾免疫等相关基因进行了克隆、重组表达及病原刺激条件下基因在mRNA水平上表达变化的研究。从中国明对虾中获得了抗菌蛋白(CruFc-1)和铁蛋白(FcFer)的全长cDNA序列; 在大肠杆菌中完成了CruFc-1、CshFc、FcFer和MIH的体外重组表达与分离纯化; 在毕赤酵母中完成了CruFc-1的重组表达并成功的进行了5 L发酵罐的放大实验; 通过胶内酶切与LC-ESI-MS技术对重组蛋白rMIH和rFcFer进行了验证; 利用染色体步移技术克隆了抗菌蛋白CruFc-1的启动子序列。现将主要结果介绍如下: 利用抗菌蛋白部分氨基酸序列设计兼并引物,通过RACE的方法从中国明对虾血细胞中克隆了1条crustin-like基因(CruFc-1)的全长cDNA序列。CruFc-1 cDNA全长523 bp,编码134个氨基酸,其中包括17个氨基酸的信号肽。该基因无内含子。利用染色体步移方法成功克隆出CruFc-1的启动子序列。半定量RT-PCR实验发现,注射灭活的混合细菌(鳗弧菌和金黄色葡萄球菌)后,对虾血细胞中CruFc-1的表达量基本没有变化,结果表CruFc-1的转录不会因为微生物的刺激而加强。在E. coli成功的对两条基因的成熟肽进行了体外重组表达并分别对其抑菌活性进行了检测,结果发现rCruFc-1可以有效的抑制革兰氏阳性菌的生长。研究结果证明crustin分子C端保守的4个二硫键的核心结构(4-DSC)是crustin具有抗菌活性的必要条件。在毕赤酵母表达系统中实现了CruFc-1的重组表达并在5 L发酵罐中进行了初步的放大实验并确定了部分发酵参数。利用EST提示信息成功克隆了ferritin基因(FcFer)的全长cDNA序列。FcFer cDNA全长1221 bp,编码170个氨基酸,无信号肽。其5’上游非编码区有一金属响应元件IRE(Iron-responsive element),该元件的mRNA二级结构为典型的“茎-环”结构。金属离子刺激(Cu2+与Zn2+)与WSSV感染均能使其表达明显上调。利用E. coli成功的对其进行了体外重组表达,为进一步在蛋白水平上研究其功能提供了条件。在本实验室已经克隆了中国明对虾MIH全长cDNA序列的基础上,利用原
论文目录:
第一章 文献综述
1.1 前言
1.2 甲壳动物免疫系统
1.2.1 细胞免疫
1.2.2 体液免疫
1.3 抗菌肽(蛋白)
1.3.1 抗菌肽的分类
1.3.2 抗菌肽的作用机理
1.3.3 对虾抗菌肽
1.4 铁蛋白
1.4.1 铁蛋白的结构
1.4.2 铁蛋白的分类
1.4.3 铁蛋白的功能
1.5 蜕皮抑制激素的研究进展
1.6 功能基因的体外重组表达
1.6.1 分类
1.6.2 E. coli 和P. pastoris 表达系统的优缺点
1.7 展望
1.8 本研究的内容和意义
第二章 中国明对虾抗菌蛋白crustin 基因的克隆与功能分析
第一节 中国明对虾抗菌蛋白CruFc-1 基因的克隆及序列分析
2.1.1 材料与方法
2.1.2 结果
2.1.3 讨论
第二节 CruFc-1 基因5’上游侧翼序列的扩增
2.2.1 材料与方法
2.2.2 结果
2.2.3 讨论
第三节 CruFc-1 与CshFc 在大肠杆菌中的重组表达与分离纯化
2.3.1 材料与方法
2.3.2 结果
2.3.3 讨论
第四节 CruFc-1 在毕赤酵母中的重组表达与发酵参数的确定
2.4.1 材料与方法
2.4.2 结果
2.4.3 讨论
第三章 中国明对虾铁蛋白FcFer 基因的克隆与表达分析
3.1 前言
3.2 材料与方法
3.2.1 实验动物
3.2.2 FcFer 的克隆
3.2.3 WSSV 感染实验
3.2.4 重金属刺激实验
3.2.5 FcFer 在E. coli 中的重组表达及分离纯化
3.2.6 铁离子摄取实验
3.2.7 胶内酶切与质谱鉴定
3.3 结果
3.3.1 FcFer 全长cDNA 序列的克隆
3.3.2 FcFer 的分子系统进化分析
3.3.3 WSSV 感染后FcFer 转录水平表达量的变化
3.3.4 金属离子刺激后FcFer 转录水平表达量的变化
3.3.5 FcFer 的重组表达与分离纯化
3.3.6 铁离子摄取检测
3.3.7 重组FcFer 的质谱鉴定
3.4 讨论
第四章 中国明对虾MIH 的重组表达、分离纯化及质谱鉴定
4.1 前言
4.2 材料与方法
4.2.1 实验材料
4.2.2 实验方法
4.3 结果
4.3.1 成熟肽cDNA 片断的扩增
4.3.2 重组表达载体的构建
4.3.3 目的蛋白的表达与纯化
4.3.4 表达产物的Western blot 检测
4.3.5 重组MIH 的质谱鉴定
4.4 讨论
结论
参考文献
博士期间发表文章
致谢
发布时间: 2006-04-28
参考文献
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