鸭疫里默氏杆菌荚膜多糖输出蛋白基因的发现及其免疫原性研究

论文摘要

鸭疫里默氏杆菌病是家鸭、火鸡和多种其它鸟类的一种接触传染性疾病。该病呈世界范围分布，已在几乎所有的集约化养鸭生产的国家发现。该病的发病率和死亡率较高，已成为目前危害世界各国养鸭业最为严重的传染病之一，给养鸭业造成了巨大的经济损失。到目前为止，关于鸭疫里默氏杆菌的分子生物学研究资料较少，国内外尚无关于血清1型RA基因文库的研究报告。由于目前我国鸭疫里默氏杆菌病流行的血清型以1型出现频率最高，因此我们以血清1型RA菌株为材料构建基因文库，以期筛选出相应的抗原基因，为RA基因工程疫苗研究奠定基础，为该病的诊断与流行病学监测提供高纯度的特异性抗原。 本研究以血清1型RA CH-1株为材料，酚氯仿抽提基因组DNA。采用限制性内切酶Sau3A Ⅰ进行部分酶切消化，首先小量酶切优化确定酶切时间和作用浓度，然后在小量酶切预试验基础上扩大反应体系进行酶切，采用试剂盒纯化回收1.0kb-6.5kb片段，将其用T4 DNA连接酶与经BamH Ⅰ酶切并去磷酸化的ZAP Express载体进行连接，用噬菌体包装蛋白包装。经测定包装滴度为5.23×106pfu／ml，蓝白斑筛选重组率为96.8％，表明已成功构建血清1型RA基因文库。 在成功构建RA基因文库的基础上，采用兔血清对文库进行免疫筛选，获得了3个阳性斑，并对其中一个进行了复筛及纯化，对该阳性斑进行体内删除，对获得含插入片段的噬菌粒进行酶切鉴定正确后进行测序，并将该序列递交GenBank，获得登录号为DQ151838。 通过核酸序列相似性搜索比对、ORF分析、基因预测，初步判定ORF1110读框是一个完整的有意义ORF，是与荚膜多糖蛋白相关的基因；ORF1155读框则与外膜蛋白相关，但起始密码子上游未发现RBS（可能与起始密码子上游序列长度太短有关），因此无法判断是否是一个真正的ORF；而ORF2141读框囿于序列长度只有起始密码子而没有终止密码子，因此并不是一个完整的ORF，有必要通过试验来补齐这段序列再进行分析；通过蛋白质序列搜索比对、亚细胞定位、跨膜区、疏水性预测分析，进一步证实ORF1110与荚膜多糖生物合成密切相关，而ORF1155则与包括外膜蛋白、表面抗原的多个蛋白家族相关；采用软件进行抗原性预测分析表明ORF1110

论文目录

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• 缩略词表
• 第一章 鸭疫里默氏杆菌病的研究进展
• 1 概述
• 2 病原学
• 2.1 分类地位
• 2.2 血清型
• 2.3 血清亚型
• 3 诊断
• 4 免疫原性研究
• 5 致病因子研究
• 6 耐药性的研究
• 7 疫苗研究
• 7.1 灭活苗的研究
• 7.2 弱毒苗的研究
• 7.3 亚单位疫苗的研究
• 第二章 cDNA文库构建技术及其筛选策略
• 1 构建cDNA文库的基本原理及主要步骤
• 1.1 基本原理
• 1.2 主要步骤
• 2 cDNA全长文库的构建
• 3 均一化cDNA文库
• 4 差减cDNA文库
• 5 固相cDNA文库（solid-phase cDNA library）
• 6 cDNA文库的筛选策略
• 6.1 从非全长cDNA文库中筛选新基因
• 6.2 从全长cDNA文库中进行杂交筛选
• 7 小结
• 第三章 血清1型鸭疫里默氏杆菌基因文库的构建及鉴定
• 1 材料
• 1.1 菌株和载体
• 1.2 主要仪器设备
• 1.3 主要试剂
• 1.4 其它材料
• 2 方法
• 2.1 细菌培养及基因组DNA的提取
• 2.2 基因组DNA的部分酶切及回收
• 2.3 连接
• 2.4 包装
• 2.5 滴定
• 2.6 蓝白斑计数
• 2.7 文库的扩增与贮存
• 3 结果
• 3.1 RA基因组DNA的完整性及纯度
• 3.2 基因组DNA部分酶切片段的制备
• 3.3 RA基因组文库的建立
• 3.4 蓝白斑计数
• 4 讨论
• 4.1 基因组DNA的完整性
• 4.2 构建文库载体的选择
• 4.3 限制性内切酶的选择及酶切条件的优化
• 4.4 基因组文库的鉴定
• 5 小结
• 第四章 血清1型鸭疫里默氏杆菌基因文库的免疫筛选
• 1 材料
• 1.1 菌株及基因组文库
• 1.2 Lambda DNA及限制性内切酶
• 1.3 试验动物
• 1.4 主要试剂
• 1.5 主要仪器
• 1.6 其它材料
• 2 方法
• 2.1 血清1型RA抗血清的制备
• 2.2 抗血清的预处理
• 2.3 一抗浓度的确定—斑点印迹试验
• 2.4 文库的免疫筛选
• 2.5 阳性斑的体内删除（in vivo excision）
• 3 结果
• 3.1 RA抗血清的制备及吸附处理
• 3.2 一抗浓度的确定
• 3.3 阳性噬菌斑的筛选及纯化
• 3.4 阳性斑的酶切鉴定及测序结果
• 4 讨论
• 4.1 筛选条件的优化
• 4.2 阳性斑的体内删除及酶切鉴定
• 5 小结
• 第五章 序列的生物信息学分析
• 1 序列载体污染分析
• 2 序列相似性搜索
• 3 ORF（Open Reading Frame）预测
• 4 采用NCBI的BLASTP 2.2.13工具对各个ORF进行逐一分析
• 4.1 ORF2141
• 4.2 ORF2076
• 4.3 ORF1155
• 4.4 ORF1110
• 4.5 ORF1104
• 5 采用FASTA程序进一步分析
• 5.1 ORF2141
• 5.2 ORF1155
• 5.3 ORF1110
• 6 基因预测
• 6.1 GeneMark hmm2.0程序在线预测
• 6.2 FgenesB程序在线预测
• 6.3 RBS的确定
• 7 蛋白质序列分析
• 7.1 ORF1155
• 7.2 ORF1110
• 8 分别采用软件ANTHEPROT v5.0和Lasergene7进行抗原性分析
• 8.1 ORF1155
• 8.2 ORF1110
• 9 结果和讨论
• 9.1 原始序列中载体污染的判定
• 9.2 序列相似性搜索
• 9.3 ORF预测
• 9.4 基因预测
• 9.5 蛋白质序列结构与功能预测
• 9.6 亚细胞定位
• 9.7 跨膜区预测
• 9.8 疏水性分析
• 9.9 抗原性预测
• 10 小结
• 第六章 原核表达质粒pET32-CPEP的构建与表达
• 1 材料
• 1.1 菌株及表达载体
• 1.2 主要仪器
• 1.3 主要试剂
• 1.4 其它
• 2 方法
• 2.1 表达用引物的设计与合成
• 2.2 表达用引物的PCR及测序鉴定
• 2.3 PCR产物的鉴定
• 2.4 插入片段的制备
• 2.5 连接载体pET-32c的制备
• 2.6 原核表达质粒的构建
• 5α'>2.7 连接产物转化克隆菌株DH_5α
• 2.8 转化表达菌株BL21（DE3）
• 2.9 诱导表达
• 2.10 表达产物的SDS-PAGE分析
• 2.11 免疫印迹检测
• 2.12 表达蛋白的可溶性和不可溶性分析
• 2.13 表达条件的优化
• 3 结果
• 3.1 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳及测序鉴定
• 3.2 T载体克隆及测序鉴定
• 3.3 原核表达质粒的构建及鉴定
• 3.4 诱导表达
• 3.5 免疫印迹结果
• 3.6 重组表达蛋白的可溶性和不可溶性分析
• 3.7 表达条件的优化
• 4 讨论
• 4.1 表达用引物的设计
• 4.2 T载体克隆
• 4.3 诱导表达
• 4.4 重组表达蛋白的可溶性分析
• 4.5 表达条件的优化
• 4.6 免疫印迹检测
• 5 小结
• 第七章 表达产物的纯化及其免疫原性研究
• 1 材料
• 1.1 试验动物
• 1.2 主要仪器设备
• 1.3 主要试剂
• 1.4 其它材料
• 2 方法
• 2.1 表达产物的纯化
• 2.2 重组表达蛋白的免疫原性研究
• 3 结果
• 3.1 重组表达蛋白过柱纯化效果
• 3.2 重组表达蛋白的免疫印迹结果
• 4 讨论
• 4.1 表达产物的纯化
• 4.2 重组蛋白的免疫原性
• 5 小结
• 第八章 基于荚膜多糖输出蛋白基因的PCR检测鸭疫里默氏杆菌病
• 1 材料
• 1.1 参考菌株
• 1.2 主要试剂和培养基
• 1.3 主要仪器
• 1.4 试验动物
• 1.5 其它
• 2 方法
• 2.1 检测引物的设计与合成
• 2.2 基因组DNA模板的制备
• 2.3 菌落提取液模板的制备
• 2.4 PCR扩增及条件优化
• 2.5 琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物
• 2.6 特异性实验
• 2.7 敏感性检测
• 2.8 重复性实验
• 2.9 临床初步检测
• 3 结果
• 3.1 引物BLAST结果
• 3.2 PCR条件的优化
• 3.3 特异性实验
• 3.4 敏感性检测
• 3.5 重复性实验
• 3.6 临床初步检测
• 4 讨论
• 4.1 PCR方法的建立
• 4.2 PCR条件的优化
• 4.3 PCR方法与现有检测鸭疫里默氏杆菌病的比较
• 5 小结
• 第九章 结论
• 参考文献
• 附录一 载体图谱
• 附录二 测序图谱
• 1 含插入DNA片段的pBK-CMV测序图谱，共9个反应
• 2 PCR产物测序鉴定，共1个反应
• 3 T载体克隆后测序鉴定，共2个反应
• 附录三 培养基及主要试剂溶液的配制
• 附录四 试剂盒使用说明
• 附录五 生物信息学在线分析相关网址
• 附录六 图表目录
• 致谢
• 作者简介
• 后记