大鼠边缘下区在条件性恐惧记忆消退保持中的作用机制研究

论文摘要

随着突发性灾难事件的增多,创伤后应激障碍（post-traumatic stress disorder,PTSD）成为全球关注的热点。PTSD的本质是一系列与创伤事件相关的记忆（条件性恐惧）,创伤性记忆一旦形成,很难自然消失,严重影响日常生活。暴露疗法的原理是创伤记忆的消退,但其对PTSD的疗效难以维持,表现为已消退的恐惧记忆又很快再现。提示消退保持（extinction retention）障碍可能是创伤后应激障碍发生和治疗困难的关键。既往实验表明内侧前额叶皮层（medial prefrontal cortex,mPFC）边缘下区（infralimbic area,IL）与PTSD发生、发展和治疗结局密切相关,然而,其在条件性恐惧消退保持中的作用和机制尚不清楚。我们在以往学者研究的基础上,综合行为药理学、形态学以及Western Blot方法探索条件性恐惧记忆消退的最佳“时间窗”,探讨IL区在条件性恐惧记忆消退保持中的作用及其机制,为提高并巩固PTSD治疗效果提供实验依据。为达成这一目的,设计了以下3个实验。实验一不同消退方式后条件性恐惧大鼠消退保持的动态观察目的:探讨条件性恐惧大鼠经历不同消退训练后,消退记忆保持水平的动态变化。方法:条件刺激（声音）与非条件刺激（不可逃避的足底电击）配对呈现建立条件性恐惧;随后重复呈现单独的条件刺激用于消退训练。48只SD雄性大鼠随机分为3组:对照组（自然消退,Cont组）,大鼠建立声音提示的条件性恐惧而不进行消退训练;立即消退组（Imme EXT）,建立条件性恐惧后15min进行消退训练;延迟消退组（EXT组）,建立条件性恐惧后24h进行消退训练。以上三组大鼠一半于建模后第1、3、7、20天测试僵立行为（大鼠连续10min内僵立时间百分比）;另一半分别于消退后第1、3、7、20天通过高架十字迷宫测试焦虑行为。结果:①Cont,Imme EXT和EXT组僵立行为基础值的差异无统计学意义（P>0.05）。EXT组的消退效果好于Imme EXT和Cont组（P<0.001）,其远期消退效果持续稳定;EXT组大鼠消退后第1、3天的僵立行为显著下降（P<0.01）,第7天已接近正常水平。Imme EXT组和Cont组间消退效果的差异无统计学意义（P >0.05）。各组大鼠在消退后7-20天僵立行为的变化无统计学意义（P>0.05）。②Cont,Imme EXT和EXT组的开放臂进入次数百分比（OA time%）和开放臂停留时间百分比（OA time%）基础值差异无统计学意义（P >0.05）;在消退后不同时间点,OA entries%和OA time%两个指标的差异均无统计学意义（P>0.05）。总体来说,各组动物随实验天数延长其焦虑水平逐渐降低,但各组之间在同一时间点上的焦虑水平的改变无统计学意义（P >0.05）。结论:不同的消退训练方式对条件性恐惧大鼠的远期消退效果不同,延迟消退训练方式效果最好。同时,由于不同处理组大鼠的焦虑水平类似,排除了立即消退组僵立评分值较高是焦虑水平升高所致。实验二条件性恐惧消退保持过程中IL区磷酸化CREB的动态变化目的:探讨条件性恐惧大鼠经历不同消退训练后,消退记忆保持过程中,IL区pCREB的变化。方法:实验一观察到条件性恐惧延迟消退训练效果好于立即消退训练,且消退后1-3天的消退效果最为明显。本实验采用声音-足底电击配对（条件恐惧）或非配对（非条件恐惧）刺激后,使用延迟消退方式训练大鼠,比较非条件恐惧和条件恐惧延迟消退后大鼠僵立行为变化和IL区pCREB的表达不同,同时观察条件恐惧延迟消退组在消退后1、3、7天IL区信号分子pCREB的动态变化。将SD雄性成年大鼠随机分为5组:空白组（Naive组,无任何处理）,假训练A组（Sham A,声音和足底电刺激不配对呈现）,假训练B组（Sham B,仅有足底电刺激）,条件性恐惧组（Cont组,无消退训练）,延迟消退组（EXT组）。除Cont组外,其余各组均采用与实验一相同的延迟消退训练方式,在消退后24h取材; EXT组在延迟消退后不同时间点（消退后1、3、7天）取材;各组均采用免疫荧光染色及Western Blot定位和半定量检测目标蛋白pCREB的表达水平（3-4只大鼠/时间点）。免疫荧光单一标记各组IL区pCREB以说明非条件恐惧对IL区细胞pCREB表达的影响。免疫荧光三重标记分别指:pCREB显示细胞核（绿）,Neu-N显示神经元胞体和胞核（红）,hoechst染色细胞核（蓝）。pCREB阳性细胞同时为Neu-N阳性、hoechst阳性的进行记数。以此说明延迟消退后IL区神经元的pCREB表达水平。结果:①EXT组消退后1天僵立时间百分比（48.72±10.27）显著低于Sham A（79.65±6.88）、Sham B（77.53±6.03）和Cont组（61.12±10.22）（P<0.001）,而明显高于Naive组（55.77±10.40）（P<0.01）。EXT组消退后1天（823.70±67.31）IL区pCREB阳性细胞表达显著高于Sham A（442.20±53.19）,Sham B（453.20±49.47）和Cont组（564.20±55.37） （P<0.001）,而低于Naive组（994.00±56.62）pCREB表达（P<0.01）。Sham A组和Sham B组的僵立时间百分比和IL区pCREB阳性细胞表达与Cont组相比差异无统计学意义（P>0.05）。②免疫荧光三重标记IL区pCREB阳性神经元表达数:在延迟消退后1天（45±5.70）、3天（62±8.39）、7天（66.2±7.59）大鼠IL区pCREB阳性表达数呈逐渐增加趋势,其中在消退后第1、3天增加迅速（P<0.001）,消退后3、7天的变化无统计学意义（P>0.05）,消退后第7天基本回复到正常水平。条件性恐惧组IL区pCREB阳性表达数（28±2.73）显著低于Naive组（73.2±5.31）和延迟消退组在各时间点的表达数（P<0.001）。③Western Blot结果:将β-actin表达强度作为内参,各组大鼠IL区pCREB目标蛋白表达变化如下:延迟消退组在消退后1天（0.86±0.06）、3天（1.11±0.06）、7天（1.22±0.04）的pCREB蛋白表达量持续增加（P<0.01）,消退后1、3天增加尤为突出。条件性恐惧组大鼠pCREB蛋白表达显著减少到（0.54±0.03）（P<0.001）。消退后7天的目标蛋白表达与Naive组（1.39±0.05）的差异无统计学意义（P>0.05）。结论:声音提示的条件性恐惧伴随IL区内pCREB表达水平降低,而僵立行为的改善伴随IL区pCREB表达水平的逐渐增强。延迟消退后第1-3天IL区内pCREB的表达水平显著升高,且这些表达变化主要集中在IL区神经元内。提示pCREB可能参与条件恐惧的消退。实验三NMDA受体在大鼠条件性恐惧消退保持中的作用机制研究目的:观察非竞争性NMDA受体拮抗剂MK-801对条件性恐惧大鼠消退保持及IL区pCREB表达的影响,探讨NMDA受体影响消退保持的可能机制。方法:采用延迟消退训练方法,将雄性成年SD大鼠随机分为4组。训练前腹腔注射MK-801（Pre-MK-801）组:延迟消退训练前40min腹腔注射MK-801（0.3 mg/kg）;训练后腹腔注射MK-801（Post-MK-801）组:延迟消退训练后4h腹腔注射MK-801（0.3 mg/kg）;延迟消退组（EXT）:条件性恐惧建立24h后进行消退训练,给予等量生理盐水;对照组（自然消退,Cont）:只建立条件性恐惧,不进行消退训练,给予等量生理盐水。一半大鼠于消退当日（EXT-0 d）、消退后1、3、7（EXT-1、3、7d）测定僵立时间,进行条件性恐惧消退保持研究;另一半大鼠在上述时间点进行高架十字迷宫实验,以评价实验处理后大鼠在消退期间焦虑水平的变化。同样处理的大鼠在相同的时间点被处死,用于免疫荧光、Western Blot研究（3-4只大鼠/时间点）。免疫荧光三重标记分别指:pCREB显示细胞核（绿）,Neu-N显示神经元胞体和胞核（红）,hoechst染色细胞核（蓝）。pCREB阳性细胞同时为Neu-N阳性、hoechst阳性的进行记数。以此说明延迟消退后IL区pCREB神经元表达的水平。结果:①各组大鼠僵立行为基础值的差异无统计学意义（P>0.05）。Post-MK-801组大鼠在EXT-1、3、7天的僵立行为高于EXT组的相同时间点（P<0.01）,但明显低于Pre-MK-801组和对照组（P<0.05）。Pre-MK-801组在EXT-1、3、7天的僵立行为与对照组相同时间点比较无统计学意义（P >0.05）。Cont组在EXT-7d的僵立行为低于EXT-0d（P<0.05）。在消退后各时间点上Pre-MK-801组和Post-MK-801组的僵立行为改变无统计学意义（P>0.05）。②各组大鼠进入开放臂次数百分数（OA entries%）和开放臂停留时间百分数（OA time% ）基础值的差异无统计学意义（P>0.05）。在消退后不同时间点,OA entries%和OA time%两个指标的变化无统计学意义（P>0.05）。各组大鼠焦虑水平随实验天数延长有所改善,但各组之间在同一时间点上的焦虑水平的改变无统计学意义（P>0.05）。③免疫荧光三重标记IL区pCREB的神经元数表达: Post-MK-801组（42.80±4.32）IL区pCREB阳性神经元数低于EXT组（48.80±2.39）（P<0.05）,但明显高于Pre-MK-801组（34.80±3.11）和对照组（35.60±4.16）（P<0.01）。Pre-MK-801组IL区阳性细胞数与对照组比较无统计学意义（P>0.05）。④Western Blot结果显示:将β-actin表达强度作为内参,不同给药方式大鼠IL区pCREB目标蛋白表达变化如下:Post-MK-801组（0.71±0.06）IL区pCREB阳性带明显低于EXT组（0.87±0.08）（P<0.01）,但明显高于Pre-MK-801组（0.49±0.05）和对照组（0.52±0.03）（P<0.01）。Pre-MK-801组IL区pCREB阳性带与对照组比较其差异无统计学意义性（P>0.05）。结论:在消退训练前40min、消退训练后4h腹腔注射MK-801不影响大鼠的焦虑行为,而影响其条件恐惧消退的巩固和保持。消退训练前40min腹腔注射MK-801的消退效果明显差于消退训练后4h给药,这些行为学改变伴随IL区pCREB神经元表达水平的相应改变。大鼠IL区的pCREB可能参与了条件性恐惧记忆的建立和消退过程,MK-801可能通过拮抗NMDA受体从而减弱大鼠条件性恐惧记忆的消退保持过程。这些改变主要局限于该区的神经元,提示MK-801通过拮抗NMDA受体活性,进而减弱条件性恐惧记忆消退保持过程。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾
• 第一部分 与 PTSD 创伤性记忆有关的脑结构及声音 提示的条件性恐惧的神经回路
• 第二部分 创伤性记忆的消退及其神经机制
• 第三部分 内侧前额叶皮层与创伤性记忆消退的相关研究
• 正文
• 实验一 不同消退方式后条件性恐惧大鼠消退保持的动态观察
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 实验二 条件恐惧大鼠消退保持中 IL 区磷酸化 CREB 的动态变化
• 1 引言
• 2 材料和方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 5 图片说明
• 实验三 NMDA 受体在大鼠条件性恐惧消退 保持中的作用机制研究
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 5 图片说明
• 小结
• 参考文献
• 攻读学位期间的研究成果
• 致谢