论文摘要
本研究分别提取了副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,Hps）的超声波破碎抗原和全菌抗原,作为诊断抗原,建立了检测Hps种特异性抗体的间接ELISA方法,并筛选出能检测出Hps种特异性抗体的最佳种特异性抗原。同时试验提取了Hps 15个血清型的耐热抗原,建立了检测Hps型特异性抗体的间接ELISA方法。通过血清型间的交叉反应试验,能检测出部分不同的Hps血清型,为Hps的准确诊断与抗体检测分型提供新的思路和方法。1.副猪嗜血杆菌ELISA检测的抗原制备本试验制备了三种包被抗原:1.将培养的10ml Hps菌液中加入终浓度为0.2%甲醛灭活1d,洗涤菌体后定容到3ml,此为全菌抗原的标准原液,含菌量为3.33×109CPU/ml;2.将培养的10ml Hps菌液离心后,洗涤菌体,最后按菌体体积的50倍量加入PBS缓冲液,将其在冰浴中以160W超声波间歇破碎20min,离心取上清,此为超声波破碎抗原标准原液,其蛋白浓度为2.84 mg/ml。3.将培养的10ml Hps菌液离心后,洗涤菌体后,将其置于高压灭菌锅中121℃度处理2h,离心取上清液,此为耐热抗原标准原液,多糖含量为1.33 mg/ml。2.间接ELISA检测HPS抗体方法的建立本试验分别提取Hps的超声波破碎抗原、全菌抗原和耐热抗原作为诊断抗原建立了间接ELISA方法,并确定了ELISA的最佳反应条件:超声波破碎抗原、全菌抗原和耐热抗原包被浓度分别为各个抗原的标准原液稀释100倍、稀释200倍和稀释100倍,浓度分别为28.4μg/ml、1.665×107CPU/ml和13.3μg/ml,血清的最适稀释度均为320倍稀释;封闭液分别为2%脱脂牛奶37℃封闭90min,10%小牛血清37℃封闭90min,2%脱脂牛奶37℃封闭120min;酶标二抗反应条件三者均为是6000倍稀释,37℃孵育30min;阻断试验表明:三种抗原均能阻断该型阳性血清与相应包被抗原的反应。特异性试验表明:建立的ELISA方法均不与猪传染性胸膜肺炎放线杆菌阳性血清、猪链球菌阳性血清、多杀性巴氏杆菌阳性血清和大肠杆菌阳性血清反应。重复性试验表明:血清的批内重复性试验变异系数小于7%,批间重复试验变异系数小于8%,表明建立的间接ELISA方法具有良好的可重复性。将分别包被三种抗原的间接ELISA方法与Hps 1-15个血清型的阳性血清进行交叉反应试验,交叉反应结果如下:超声波破碎抗原和全菌抗原作为诊断抗原的间接ELISA都能与各个Hps血清型的阳性血清发生交叉反应;Hps血清4型耐热抗原不与血清型10型的阳性血清反应;8型的耐热抗原不与血清型4、5和14型的阳性血清反应;10型耐热抗原不与血清3、4、6、8和12型的阳性血清反应。3.间接ELISA检测HPS抗体方法的临床初步检测应用用超声波破碎抗原和全菌抗原作为包被抗原建立的两种间接ELISA方法分别对来自于四川省和重庆市的四个猪场共162份血清的副猪嗜血杆菌抗体进行检测,用间接血凝试验做对照。包被全菌抗原、超声波破碎抗原建立的间接ELISA方法相对于间接血凝方法的符合率分别为98.15%和97.53%,故以全菌抗原作为包被抗原建立的ELISA检测Hps的种特异性抗体效果较好。分别将Hps 15种血清型提取的耐热抗原作为包被抗原建立的ELISA,检测间接血凝试验检测呈阳性的临床血清,结果显示:有27份阳性血清为血清型4型,有3份可能为血清5型或血清14型。尽管本研究提取的部分血清型的耐热抗原与其它血清型间的交叉反应不能完全避免,但缩小了诊断的范围,可将Hps的血清型定于某特定的几个血清型间,为进一步的鉴定减小了工作量。