论文摘要
背景垂体腺瘤是一种严重危害人类身心健康的脑良性肿瘤,部份垂体腺瘤具有向周围结构尤其是海绵窦侵袭的特征。目前侵袭性垂体腺瘤向海绵窦侵犯的机制尚不清楚,其生物学特征和组织学特征相背离的现象令人困惑,难以找到合适的理论和作用机制来解释。海绵窦特殊的微环境可能是肿瘤侵袭的重要因素。细胞表面受体DDR1具有接受肿瘤微环境信号,启动磷酸化通路并上调MMP-2/9表达、促进肿瘤细胞侵袭的能力,可能在垂体腺瘤细胞和肿瘤的微环境的相互作用中起到重要作用。本课题利用基因工程技术,采取真核表达系统纯化出DDR1的可溶性特异竞争阻断蛋白NDDR1。课题以临床磁共振影像学为侵袭性判断标准,在大量组织标本免疫组化结果的基础上,以NDDR1和nilotinib对原代培养的垂体腺瘤细胞DDR1进行干预研究,旨在明确垂体腺瘤中DDR1对MMP-2/9和侵袭能力的调节作用,探讨DDR1在垂体腺瘤海绵窦侵袭发病过程中的作用和相关机制。第一部分:DDR1和MMP-2/9在人垂体腺瘤组织中的表达和相关性研究目的:明确DDR1、MMP-2/9在各类型垂体腺瘤组织中的表达及其同肿瘤生物学行为的关系,探讨DDR1和MMP-2/9的相关性。方法:肿瘤组织标本按MRI表现分为侵袭组和非侵袭组,按临床和免疫组化分为功能性腺瘤组和无功能腺瘤组。共聚焦显微镜下观察DDR1的细胞定位;免疫组化观察DDR1和MMP-2/9蛋白的表达情况;Western blot对DDR1和MMP-2/9的表达进行半定量分析;同时采用即时荧光定量PCR检测各组的DDR1、MMP-2/9mRNA表达水平。结果:1.DDR1表达于细胞膜;2.侵袭组中DDR1蛋白和mRNA水平显著高于非侵袭组（P＜0.01）,功能性腺瘤组显著高于无功能腺瘤组（P＜0.01）;3.侵袭组MMP-2/9蛋白和mRNA水平显著高于非侵袭组（P＜0.01）,功能性腺瘤组和无功能腺瘤组无显著差异（P＞0.05）;4.DDR1和MMP-2之间有正相关性（r=0.857,P＜0.01）,DDR1和MMP-9之间有正相关性（r=0.813,P＜0.01）。结论:DDR1和垂体腺瘤的侵袭性有关;DDR1可能通过上调MMP-2/9的表达,从而增强垂体腺瘤的侵袭性。第二部分:重组DDR1竞争阻断蛋白（NDDR1）的制备和活性鉴定目的:制备DDR1的可溶性特异竞争阻断蛋白（NDDR1）;对重组NDDR1进行活性鉴定,确定其阻断垂体腺瘤原代培养细胞DDR1的量效关系。方法:扩增DDN1胞外区,构建真核表达质粒pcDNA3.1-NDDR1,瞬时转染293细胞,纯化获得NDDR1蛋白;ELISA竞争抑制实验验证NDDR1的生物学活性,确定阻断垂体腺瘤原代培养细胞DDR1的最佳剂量。结果:1.获得哺乳动物系统表达和纯化的NDDR1蛋白3mg/L;2.竞争抑制实验示NDDR1具有可竞争阻断细胞表面天然DDR1受体的能力;3.2μg/L的NDDR1即可阻断原代培养的垂体腺瘤DDR1。结论:可溶性竞争阻断蛋白NDDR1可特异性阻断原代培养的垂体腺瘤DDR1受体。第三部份原代培养细胞中胶原Ⅰ-DDR1-MMP-2/9环路的激活目的:确定垂体腺瘤原代培养细胞中诱发DDR1信号通路的胶原类型,研究启动DDR1信号通路后Tyr磷酸化水平的变化,探讨细胞水平DDR1调节MMP-2/9表达的作用,体外论证垂体腺瘤海绵窦侵袭中胶原Ⅰ-DDR1-MMP-2/9环路的激活过程。方法:原代培养垂体腺瘤细胞中,给予外源性胶原Ⅰ、胶原Ⅱ、胶原Ⅲ、胶原Ⅳ刺激,细胞上清液行ELISA法以确定诱发DDR1信号通路的胶原类型;免疫沉淀法测定NDDR1和nilotinib干预前后Tyr磷酸化水平;明胶酶谱法和ELISA法测量刺激和阻断DDR1信号通路后MMP-2/9活性和表达水平的变化情况;建立Transwell侵袭模型小室,镜下计数观察NDDR1和nilotinib干预前后细胞侵袭能力的变化。结果:成功对9例垂体腺瘤进行原代培养。1.胶原Ⅰ是激发垂体腺瘤DDR1信号通路的主要胶原类型;2.胶原Ⅰ刺激后Tyr磷酸化水平明显升高（P＜0.05）,NDDR1和nilotinib可抑制自磷酸化;3.胶原Ⅰ刺激后显著提高MMP-2/9的表达（P＜0.05）,NDDR1和nilotinib可抑制该效应;4.NDDR1和nilotinib干预后细胞侵袭能力下降（P＜0.05）。结论:胶原Ⅰ通过诱发DDN1的磷酸化上调MMP-2/9的表达,从而增强垂体腺瘤的侵袭能力,阻断DDR1可有效降低肿瘤的侵袭性;体外证实了胶原Ⅰ-DDR1-MMP-2/9环路的激活可能是垂体腺瘤海绵窦侵袭的重要环节和发生机制。两侧海绵窦壁高表达胶原蛋白1可能是垂体腺瘤海绵窦壁侵袭的病理基础之一。
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