论文摘要
水稻是最重要的粮食作物之一,全世界有近半数的人口以稻米为主食。稻瘟病是由子囊菌（Magnaporthe grisea,无性世代为Pyricularia grisea）引起的广泛发生于世界各水稻产区的主要真菌病害,由于病原菌致病性的高度分化,使得对稻瘟病很难有效控制。长期的实践证明,培育和利用抗病品种是稻瘟病有效防治最有用的办法。随着基因工程的发展,利用转基因技术导入外源基因改良稻瘟病抗性已成为一条新途径,利用该技术可向现有栽培品种中导入外源抗病基因而不受种属限制,拓展了可利用基因的来源。籼稻是栽培水稻的主要品种类型,与粳稻相比,大量籼稻品种具有较差的组培特性和低转化效率,这种现状严重限制了转基因技术在籼稻育种上的应用。抗稻瘟病基因Pi-d2在水稻根、茎、叶中均为组成型表达,编码的蛋白其氨基末端含有一个17个氨基酸的胞外结构域信号肽和信号识别区,羧基末端为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性区,中间为一个疏水的跨膜结构,可能是一类新的抗病基因。本研究首次利用农杆菌介导法将Pi-d2基因转入籼稻品种蜀恢527和粳稻品种中花11中,进行了分子生物学检测、GUS活性检测和抗病性鉴定,建立了适合于蜀恢527的高效植株再生体系,初步得到了对稻瘟病抗性提高的水稻材料,为水稻及其它禾本科植物抗病分子育种奠定了基础。主要研究结果如下:1.不同受体材料、不同外植体的愈伤组织诱导率不同,蜀恢527、蜀恢498、中花11和台北309四个品种的幼胚愈伤组织诱导率最高分别为88.7%、87.5%、91.4%和96.0%,成熟胚愈伤组织诱导率最高分别为78.5%、75.3%、85.1%和86.3%。对四个水稻材料而言,总体表现为幼胚出愈率高于成熟胚,粳稻出愈率高于籼稻。2.建立了适合籼稻品种蜀恢527遗传转化的高效植株再生体系。实验结果表明,在基本培养基NMB中添加2.0 mg/L 2,4-D有利于蜀恢527愈伤组织的诱导和继代培养;MS+2.0 mg/L 6-BA+2.0 mg/L KT+0.25 mg/L NAA的分化培养基有利于愈伤组织的分化;继代两次的愈伤组织分化率最高,部分干燥处理分化前的愈伤组织有利于分化。3.抗性愈伤率和出苗率是影响转基因效率的主要因素,尤以后者的影响最大。在实验中发现,蜀恢498经过潮霉素筛选后虽然能得到大量的抗性愈伤组织,但是分化成苗很困难。4.转Pi-d2基因水稻植株的获得。以不同水稻品种的幼胚和成熟胚作为外植体,通过农杆菌介导法将目的基因的三种不同表达载体（pCB6.3kb、pCB5.3kb、pZH01-2.72kb）导入水稻中,最终共得到292株再生植株,对其进行目的基因的PCR检测,有176株显示为阳性,其中蜀恢527有87株,蜀恢498有1株,中花11有37株,台北309有51株。对Pi-d2基因进行了RT-PCR分析,结果表明Pi-d2基因在转录水平上得到了表达。5.对转基因植株T1代的潮霉素抗性分析表明,蜀恢527和台北309分别有64.6%和68.2%的株系表现3:1的分离,符合孟德尔单基因遗传规律,表明外源基因多数是以单位点形式整合。6.转基因植株稻瘟病抗性提高。对25个独立转基因株系的T1代植株接种结果表明,转基因植株对稻瘟病生理小种ZB15的抗性提高,病斑大小和数量减少,抗性呈孟德尔和非孟德尔分离。目的基因三种表达载体在受体中所表现的对ZB15的抗性无明显差异。7.转基因植株农艺性状无显著可遗传变异。对转基因水稻当代及T1代的重要农艺性状考查结果表明,转基因的插入和组培过程可能导致受体的一些农艺性状的变异,但绝大多数是不可遗传的,在后代中能够恢复。