OsVIP1基因RNAi水稻转化植株构建和水稻中与VirE2互作蛋白的筛选

论文摘要

水稻是当今世界重要的粮食作物之一,长期以来人们通过传统的育种方法来改良水稻品质,但是由于各方面因素的限制,使得对水稻的深入研究出现了瓶颈。随着转基因技术的发展,通过农杆菌介导可以实现将外源基因导入到水稻体内并整合进染色体,最终在转基因植株体内稳定地遗传和表达。转基因技术为研究如何提高水稻品质带来了新途径和希望。由于水稻不是农杆菌的天然寄主,因此转化效率较低成为水稻特别是籼稻转化中的一个关键问题。农杆菌侵染植物的过程涉及农杆菌和植物体内诸多蛋白的参与,对这些蛋白研究会使我们进一步了解具体的转化过程,将会为我们利用分子生物学手段提高农杆菌介导的水稻遗传转化效率提供一定的思路。拟南芥AtVIP1（Arabidopsis thaliana VirE2-interacting protein 1）蛋白在农杆菌介导的烟草和拟南芥转化中起着重要作用,如在T-复合物的形成,进入受体细胞核,整合进入受体植物染色体这些关键步骤中扮演着重要角色。因此研究水稻中拟南芥AtVIP1蛋白的同源蛋白具有重要意义。本实验通过同源性比对从水稻品种日本晴中得到与拟南芥AtVIP1同源性最高的蛋白,命名为OsVIP1,构建了该蛋白基因cDNA 2个片段（R1和R2）的RNAi植物转化载体并成功转化水稻品种中花11。对T0代转基因愈伤进行了观察统计；对T0代再生转基因植株进行了阳性苗检测和基因表达量分析。同时,本实验利用酵母双杂交技术以农杆菌VirE2蛋白作为诱饵筛选水稻日本晴cDNA文库,以期获得水稻体内与其互作的其它未知蛋白。研究获得的主要结果如下：1.成功构建了OsVIP1蛋白基因cDNA 2个片段（R1和R2）的RNAi植物表达载体pDS1301-2-R1和pDS1301-2-R2并转化中花11；2.详细观察并统计了RNAi转基因中花11抗性愈伤生长状况,RNAi实验组中花11再生抗性愈伤的比例明显低于对照组；3.对2个片段的所有T0代RNAi转基因水稻植株进行了阳性率检测,其中片段R1共得到35株转基因阳性植株,片段R2共得到32株转基因阳性植株；4.利用RT-PCR半定量方法对片段R1、R2的部分T0代转基因水稻植株中OsVIP1和PBZ1基因表达量进行了检测,结果表明转基因水稻植株中OsVIP1基因的表达量不同程度的被抑制：PBZI基因的表达量也有所下降；5.以VirE2作为诱饵蛋白筛选水稻品种日本晴cDNA文库,共获得阳性酵母克隆142个,经PCR检测表明插入片段大于500bp的62个,53个测序成功,最后获得2个阳性的酵母克隆作为候选研究对象。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词
• 第一章 文献综述
• 1.1 农杆菌介导的水稻遗传转化
• 1.2 AtVIP1的研究进展
• 1.2.1 AtVIP1的发现
• 1.2.2 AtVIP1的结构特征
• 1.2.3 AtVIP1在T-复合物进入细胞核中的作用
• 1.2.4 AtVIP1在T-复合物在细胞核内转移过程中的作用
• 1.2.5 AtVIP1在T-DNA进行基因组整合过程中的作用
• 1.2.6 AtVIP1参与植物的免疫应答反应并调控相关防御基因表达
• 1.2.7 问题和展望
• 1.3 植物基因功能的研究方法
• 1.3.1 RNAi技术研究进展
• 1.3.1.1 RNAi的发现
• 1.3.1.2 RNAi的作用机制
• 1.3.1.3 RNAi技术的特点
• 1.3.1.4 RNAi在植物功能基因组研究中的作用
• 1.3.2 酵母双杂交技术研究进展
• 1.3.4 超表达（Over-expression）
• 1.4 研究目的和意义
• 第二章 OsVIP1基因的RNAi载体构建及水稻转化
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料和方法
• 2.2.1 水稻遗传转化受体
• 2.2.2 菌株
• 2.2.3 载体
• 2.2.4 主要试剂
• 2.2.5 本实验所用引物
• 2.2.6 构建OsVIP1基因的RNAi载体片段的获得
• 2.2.6.1 OsVIP1片段的获得
• 2.2.6.2 OsVIP1 RNAi特异性片段的选择和引物设计
• 2.2.6.3 OsVIP1 RNAi特异性片段的PCR扩增,纯化
• 2.2.7 OsVIP1 RNAi载体构建
• 2.2.7.1 片段R1和R2与pGEM-T-Easy载体的连接
• 2.2.7.2 片段R1和R2与RNAi载体的正方向连接
• 2.2.7.3 片段R1和R2与RNAi载体的反方向连接
• 2.2.8 RNAi载体转化根癌农杆菌EHA105
• 2.2.9 根癌农杆菌EHA105介导的水稻遗传转化
• 2.2.9.1 农杆菌的培养
• 2.2.9.2 水稻粳稻品种中花11愈伤的诱导
• 2.2.9.3 水稻粳稻品种中花11愈伤的诱导继代
• 2.2.9.4 农杆菌EHA105悬浮培养准备
• 2.2.9.5 农杆菌侵染与共培养
• 2.2.9.6 水洗和第一次筛选,第二次筛选
• 2.2.9.7 抗性愈伤的分化
• 2.2.9.8 分化的再生植株生根
• 2.2.9.9 炼苗和移栽
• 2.2.10 RNAi载体转化中花11愈伤检测
• 2.2.10.1 RNAi转基因水稻中花11抗性愈伤统计
• 2.2.11 RNAi转基因植株的检测
• 2.2.11.1 PCR鉴定T0代转基因植株阳性苗
• 2.2.11.2 RT-PCR法检测T0代转基因植株中目标基因表达量的变化
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 RNAi载体的构建
• 2.3.1.1 水稻中VIP1蛋白（OsVIP1）与拟南芥VIP1蛋白（AtVIP1）的同源性比对
• 2.3.1.2 OsVIP1 RNAi特异性片段R1和R2的克隆
• 2.3.1.3 R1和R2片段RNAi载体的构建
• 2.3.2 RNAi载体转化中花11愈伤转化效率的检测
• 2.3.2.1 RNAi转基因水稻中花11抗性愈伤统计
• 2.3.3 RNAi转基因植株的检测
• 2.3.3.1 T0代转基因植株筛选标记潮霉素检测
• 2.3.3.2 RT-PCR法检测T0代转基因植株OsVIP1和PBZI基因表达量
• 2.4 讨论
• 2.4.1 OsVIP1可能参与农杆菌介导的水稻遗传转化过程
• 2.4.2 防卫基因PBZI可能和OsVIP1基因存在着密切关系
• 第三章 水稻中与VIRE2相互作用的蛋白的筛选
• 3.1 前言
• 3.2 实验材料和方法
• 3.2.1 菌株
• 3.2.2 载体
• 3.2.3 本实验中所用到的引物
• 3.2.4 主要试剂
• 3.2.5 BD-VirE2载体的构建
• 3.2.5.1 EHA105中的毒性蛋白VirE2序列
• 3.2.5.2 VirE2基因PCR产物回收与pGEM-T-Easy载体连接
• 3.2.5.3 VirE2与pGBKT7载体连接
• 3.2.6 BD-VirE2转化酵母Y187
• 3.2.7 BD-VirE2自激活检测
• 3.2.8 用BD-VirE2筛选日本晴叶片cDNA酵母双杂交文库--Mating
• 3.2.9 BD-VirE2筛选日本晴cDNA酵母双杂交文库所得克隆的检测
• 3.2.9.1 PCR检测pGADT7载体中插入片段的片段大小
• 3.2.9.2 PCR产物测序和序列比对
• 3.2.10. 对候选克隆的进一步验证
• 3.2.10.1 在X-α-Gal的四缺皿上显色
• 3.2.10.2 候选阳性克隆验证
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 BD-VirE2载体的构建
• 3.3.2 BD-VirE2自激活检测
• 3.3.3 BD-VirE2筛选日本晴cDNA酵母双杂交文库所得克隆的检测
• 3.3.3.1 PCR检测pGADT7载体中插入片段的片段大小
• 3.3.3.2 阳性酵母克隆PCR片段测序和序列比对
• 3.3.4 候选克隆的进一步检测
• 3.3.4.1 候选克隆Y-OsGH3和Y-OsAOR显色实验
• 3.3.4.2 候选阳性克隆验证
• 3.4 讨论
• 3.4.1 关于VirE2筛选日本晴cDNA酵母双杂交文库的实验结果
• 3.4.2 关于VirE2筛选日本晴cDNA酵母双杂交文库实验的一些思考
• 参考文献
• 附录1 粳稻转化培养基配方
• 附录2 反转录实验步骤
• 附录3 农杆菌EHA105感受态细胞制备
• 附录4 酵母细胞感受态的制备和酵母转化
• 附录5 酵母细胞Y187筛选CDNA文库的操作步骤
• 致谢