多环芳烃—菲、萘降解菌株的分离、降解特性及降解机制研究

论文摘要

多环芳烃（Polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs）是一类在环境中广泛存在、具有毒性的污染物,对人类健康和生态环境具有很大危害,已被多个国家列为优先控制的环境污染物。在PAHs的各种降解方法中,微生物降解是其主要降解途径,一直受到人们的高度重视。本研究从西安焦化厂附近污染土壤中分离得到两株菲、萘降解细菌A和B,经16SrDNA测序分析,鉴定菌株A属于不动杆菌属（Acinetobacter sp.）,菌株B属于假单胞菌属（Pseudomonas sp.）,其同源性均为99%。另有一株菲、萘降解细菌C,为实验室保存的野生型铜绿假单胞菌PAO1。A、B、C三株菌均能以菲、萘为唯一碳源生长,通过实验对这三株菌的菲、萘降解特性及降解机制进行了测定和研究。实验确定了菌株最适菲生长及降解的温度、pH培养条件：A、B、C三株菌的最适生长温度分别为34℃、34℃和37℃,最适降解温度分别为34℃、34。C-37℃和37℃；最适生长pH分别为7.5、7.0和7.0,最适降解pH均为7.0。菌株的萘最适培养条件与菲一致。增加溶氧量可以促进菌株对菲、萘的降解,说明三株菌均采用好氧降解方式降解菲、萘。实验还表明,对于菲的降解,不同菌株混合培养均优于任一菌株的单独培养,可能因为混合培养会导致不同菌株PAHs降解酶及相关蛋白产生的相互弥补和促进。表面活性剂吐温（Tween-80）或曲拉通（Triton X-100）的添加有利于三株菌对菲、萘的降解,且对菌株A的促进降解作用更为明显。可能是由于表面活性剂提高了PAHs的溶解度,使其容易进入微生物的降解系统,而假单胞菌自身具有编码生物表面活性剂鼠李糖脂的rhlAB基因,使得外加表面活性剂的PAHs增溶作用并不明显。低浓度抗生素四环素（Tc）和万古霉素（Van）也可促进三株菌对菲、萘的降解,推测是由于低浓度抗生素可能对菌体某些基因的表达产生了重要的调节作用,如激活假单胞菌编码生物表面活性剂鼠李糖脂的rhlAB基因的表达。优化菌株的培养条件,在菌体生长和菲、萘降解处于最佳状态的条件下测定菌株的降解率：两天内菌株A、B和C的最大菲降解率分别为80.4%、86.6%和85.7%,两天内菌株A、B和C的最大萘降解率分别为83.1%、92.7%和90.2%。以菲降解中间产物水杨酸、邻苯二甲酸为唯一碳源进行的三株菌菲降解途径的初步研究可知,菌株A可能具有水杨酸途径,菌株B、C可能同时具有水杨酸途径和邻苯甲酸途径。通过PCR及DNA序列比对对A、B、C三株菌编码菲、萘降解过程中的三个关键酶菲双加氧酶、萘双加氧酶和儿茶酚-2,3-双加氧酶基因进行了确定：菌株A仅扩增得到菲双加氧酶基因,可能是因为引物设计的同源性限制及在该菌株水杨酸途径中邻苯二酚的开环反应可能由儿茶酚-1,2-双加氧酶催化所导致；菌株B和C同时含有三个关键酶基因。在PAHs作为降解底物和压力物质的双重作用下,细菌不仅表达PAHs分解代谢途径中的降解酶,通常还会表达大量降解相关蛋白。以具有较强降解能力的菌株C——铜绿假单胞菌PAO1为研究对象,从分子水平对菲、萘降解机制进行进一步的研究。采用带有lux报道子载体构建的铜绿假单胞菌PAO1全基因组随机启动子库为平台,筛选出了20个菲、萘降解过程相关基因,通过DNA序列测定和比对进行这些基因的确定。据推测这些基因的产物可能包括生物分子合成及能量代谢相关蛋白（如基因F、基因G和基因J）、转运系统组成蛋白（如基因B）、膜相关蛋白（如基因T）及未知功能蛋白（如基因P）等。在细菌表达的大量降解相关蛋白中,转运蛋白是重要的一类,实验对RND外排泵基因在菲胁迫条件下的表达进行了研究。结果表明菲对铜绿假单胞菌PAO1中5个RND外排泵基因的表达具有一定的调节作用。由此可知,细菌对PAHs的降解不仅需要一系列降解基因的参与,更是众多降解相关基因与之同时表达的作用结果。本研究通过筛选分离菲、萘高效降解菌株,研究菌株的降解特性,并在分子水平探索其降解机制,将为PAHs生物降解工艺的优化、降解菌株的基因工程化及PAHs污染的生物修复提供相应的理论依据和治理措施。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 图目录
• 表目录
• 缩写对比表
• 第一部分 引言
• 1.1 多环芳烃及其危害
• 1.1.1 PAHs的免疫抑制反应
• 1.1.2 PAHs的致癌、致突变和致畸作用
• 1.1.3 PAHs衍生物的毒理作用
• 1.2 多环芳烃降解细菌的种类
• 1.3 多环芳烃的细菌降解
• 1.3.1 细菌对萘的降解
• 1.3.2 细菌对菲的降解
• 1.3.3 萘、菲细菌降解基因的遗传学分析
• 1.4 多环芳烃污染的生物修复及应用前景展望
• 1.5 本实验研究的内容及意义
• 第二部分 实验材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 菲降解菌株的筛选和纯化
• 2.2.2 16SrDNA测序和序列比对
• 2.2.3 菌株降解特性的研究
• 2.2.4 菌株菲降解途径及关键菲、萘降解基因的研究
• 2.2.5 铜绿假单胞菌PAO1的菲、萘降解过程相关基因的研究
• 第三部分 实验结果
• 3.1 菲降解菌株的筛选、分离和鉴定
• 3.2 菌株的降解特性
• 3.2.1 菌株的菲降解特性
• 3.2.2 菌株的萘降解特性
• 3.3 菌株菲降解途径及关键菲、萘降解基因
• 3.3.1 菌株菲降解途径
• 3.3.2 菌株关键菲、萘降解基因
• 3.4 铜绿假单胞菌PAO1的菲、萘降解过程相关基因
• 3.4.1 菲、萘对铜绿假单胞菌PAO1全基因组随机基因表达的影响
• 3.4.2 菲对铜绿假单胞菌PAO1RND外排泵基因表达的影响
• 第四部分 讨论
• 参考文献
• 附录
• 致谢