论文摘要
盐胁迫是一种世界范围很严重的环境胁迫,它会造成农作物减产和品质降低。作物只能在原位对抗盐胁迫,它进化出一种适应的分子机制,包括很多功能（代谢的、生理的和形态学的）基因的表达。这些基因参与非常广泛的胁迫适应生理及代谢过程,包括细胞解毒,物质转运,能量维持,激素响应等。而这些功能基因的表达又受到精致的调控。这些调控包括转录水平的,如对细胞外信号的感知,细胞内信号的生成与传递,基因转录的总体调节（染色质变化）,个别基因的特异转录调节;转录后水平的,如miRNA指导的靶基因转录本剪切或翻译抑制,蛋白质磷酸化和去磷酸化参与的信号途径,分子伴侣对胁迫相关蛋白质的保护,以及泛素化系统对蛋白转运信号的传递和蛋白质降解。这些基因在盐胁迫下的表达改变,就可重建细胞内稳态,达到对盐胁迫的适应和抵御。玉米,作为重要的粮食、饲料和生物能源作物,其产量对世界粮食安全影响巨大。玉米是一种盐敏感作物,而不同的玉米自交系之间,盐胁迫抗性相差很大。用高通量技术手段检测在盐胁迫条件下不同玉米自交系中表达量发生改变的转录本,对理解玉米盐胁迫响应的分子机制,揭示玉米自交系间盐胁迫抗性差异的分子基础意义重大。本研究利用高通量的技术手段SSH（消减杂交）和cDNA芯片技术检测了两个盐胁迫抗性差别很大的玉米自交系（盐胁迫敏感的黄早4和盐胁迫抗性的NC286）中表达量发生变化的转录本,认为这些转录本编码的蛋白质参与玉米的盐胁迫响应。许多调节因子和功能蛋白的编码基因在文库中被检测到。得到的主要结果包括:1、盐胁迫响应的蛋白激酶编码基因受到不同调节,而蛋白磷酸酯酶编码基因被诱导。说明盐胁迫条件下磷酸化/去磷酸化事件在胁迫信号传导中发挥作用。2、盐胁迫影响转录和翻译相关因子转录本的表达,进而影响转录、翻译的效率及特定转录本的转录和翻译。3、盐胁迫条件下,Ub/26S蛋白酶体系的作用加强,说明受损蛋白质增多,同时,蛋白酶体系的作用加强加快了氨基酸的代谢。4、盐胁迫抑制光合作用,从而影响能量供给。5、盐胁迫条件下,组蛋白和核糖体蛋白质编码基因倾向于被抑制表达,导致转录和翻译的全面抑制。6、盐胁迫下,细胞骨架成分蛋白质的编码基因倾向于受到抑制。7、与膜上物质转运相关的蛋白质编码基因都被盐胁迫条件诱导,加快膜上物质转运。对在SSH文库和cDNA芯片中共同检测到的8个ESTs,用RT-PCR技术构建了它们在不同胁迫（高盐、脱水和零上冷害）条件下玉米根系中的表达谱,发现盐胁迫和脱水胁迫的共同响应因子较多,而这两者与冷害的共同响应因子较少。microRNA是约21nt的非编码RNA,它在转录后水平调节基因的表达,广泛参与发育进程的调控,器官的极性,叶的生长及RNA代谢等。一些miRNA可被胁迫条件诱导,而且,一些miRNA的靶基因是胁迫响应基因,就暗示了miRNA可能在环境胁迫应答中起作用。利用一个含有10.1版本所有653个已知植物成熟miRNA探针的μParafloTM微流体芯片（LC science USA）,搜寻了玉米根系中盐胁迫响应的microRNAs。结果显示,在盐胁迫敏感性不同的两个玉米自交系中,存在相同响应的miRNA家族,但大多数盐胁迫响应miRNA家族在两个自交系中的表达趋势并不相同。在两自交系各个时间点表达趋势都相同的共4个,来自2个miRNA家族;在两自交系之间的表达趋势相同,但表达发生改变的时间点不同的9个,来自4个miRNA家族;在两自交系中都检测到表达改变,但表达趋势（抑制或诱导）不同的48个,来自13个miRNA家族;仅在某一个自交系中表达量发生变化的18个,来自8个miRNA家族。其中,在两个自交系中受到相同或相似调节的microRNA可能代表了共同的胁迫响应机制,而在两自交系之间受到不同调控的,尤其是仅在某一个自交系中表达量发生变化的miRNAs可用于解释两自交系不同的盐敏感性。对由高通量技术获得的盐胁迫响应ESTs和miRNA基因,分别预测了其启动子区域的主要胁迫响应cis因子。发现盐胁迫响应的编码基因和非编码基因启动子区具有共同的胁迫响应cis因子,其中,ABRE,ARE和MYBS位点的出现频率最高。这说明盐胁迫响应的蛋白编码基因与非编码基因受到相同的胁迫信号调节。
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摘要Abstract1 前言1.1 盐胁迫对植物的危害1.2 盐胁迫及植物对盐胁迫响应的可能机理1.2.1 小分子渗透调节物质1.2.2 钙离子1.2.3 活性氧1.2.4 盐胁迫对光合作用的影响1.2.5 多胺等小分子1.2.6 植物激素与盐胁迫抗性1.2.6.1 脱落酸与盐胁迫抗性1.2.6.2 赤霉素与盐胁迫抗性1.2.6.3 激动素对盐胁迫抗性的影响1.2.6.4 生长素与盐胁迫抗性1.2.7 转录因子在盐胁迫抗性中的作用1.2.7.1 b-ZIP转录因子1.2.7.2 DREB转录因子1.2.7.3 NAC转录因子1.2.8 蛋白激酶与盐胁迫抗性1.2.8.1 MAPK1.2.8.2 CDPK1.2.8.3 RLK1.2.9 蛋白质降解与盐胁迫1.2.9.1 泛素与泛素系统1.2.9.2 SUMO化1.2.9.3 泛素化体系参与植物的胁迫响应1.2.10 高通量方法广泛用于盐胁迫相关基因的检出1.2.11 小RNA与盐胁迫1.2.11.1 microRNA的形成过程1.2.11.2 microRNA以转录后抑制的方式影响靶基因的表达1.2.11.3 microRNA与发育1.2.11.4 玉米microRNA的研究情况1.2.11.5 microRNA与逆境响应1.3 本研究的目的和意义2 材料与方法2.1 植株和菌株材料2.2 植株生长条件和处理条件2.3 盐胁迫响应ESTs的获得2.3.1 玉米总RNA提取及mRNA分离2.3.2 抑制消减杂交文库构建2.3.3 消减文库的macroarray杂交2.3.4 cDNA芯片杂交2.3.5 消减文库获得片段的启动子区域的预测2.4 耐盐microRNA的获得2.4.1 microRNA芯片杂交2.4.2 microRNA基因启动子区域cis元件预测2.4.3 microRNA靶基因预测2.4.4 microRNA表达分析2.4.5 microRNA靶基因的表达分析3 结果与分析3.1 玉米两个自交系的盐抗性比较3.2 SSH文库构建及筛选3.3 cDNA文库杂交3.4 玉米的盐胁迫抗性是一种多基因控制的复杂性状,存在分子调控网络。3.4.1 盐胁迫影响转录和翻译相关因子转录本的表达3.4.2 盐胁迫响应的蛋白激酶编码基因受到不同调节,而蛋白磷酸酯酶编码基因被诱导3.4.3 盐胁迫条件下,Ub/26S蛋白酶体系的作用加强3.4.4 盐胁迫抑制光合作用3.4.5 盐胁迫条件下,核糖体蛋白质编码基因倾向于被抑制表达3.4.6 盐胁迫下,细胞骨架成分蛋白质的编码基因倾向于受到抑制3.4.7 与膜上物质转运相关的蛋白质编码基因被盐胁迫条件诱导3.4.8 盐胁迫与其它胁迫具有共同响应因子3.4.9 盐响应EST的RT-PCR分析3.4.10 盐胁迫响应ESTs的电子定位和promoter分析3.5 microRNA芯片杂交结果3.5.1 玉米根系盐胁迫响应miRNA3.5.2 两系中差异的microRNA比较3.5.3 盐胁迫响应的miRNA在胁迫条件下的可能功能3.5.4 盐胁迫响应microRNA靶基因预测,启动子区域cis位点预测3.5.5 stem-loop RT-PCR验证microRNA的表达3.5.6 microRNA靶基因的RT-PCR分析4 讨论4.1 耐盐表型筛选标准选择4.2 其它胁迫条件的响应基因在盐胁迫下的玉米细胞中也被检测到4.3 盐胁迫响应信号系统的编码基因在两自交系中的表达受到微调4.4 microRNA介导的转录后调控在玉米的盐胁迫响应中起到很大作用4.5 玉米盐胁迫响应基因的其它调节机制4.5.1 转录水平:RNA合成与RNA降解的动态平衡4.5.2 翻译水平:蛋白质正确折叠、调控、与降解的动态平衡4.5.3 翻译后水平调节4.6 两自交系中差异表达的盐胁迫响应ESTs和miRNAs可解释两系的表型差异参考文献附录附表和附图附录1 玉米自交系水培培养液配方（改良1×Hoagland's培养液）附录2 玉米组织总RNA的提取附录3 玉米mRNA的分离附录4 抑制消减杂交（SSH）文库构建附录5 显影液、定影液配方附录6 cDNA芯片杂交流程附录7 Stem-loop RT-PCR流程（据Varkonyi-Gasic等2007）附录8:玉米盐胁迫响应ESTs的电子定位附录9-A:PCR primers for microRNA promoter amplify附录9-B:5 of the maize micorRNA promoter sequences obtained by PCR amplifying and sequencing附表1:RT-PCR及Real-time RT-PCR引物序列附表2:Stem-loop RT引物及随后的PCR引物附表3:预测的micriRNA靶基因及相应RT-PCR引物附表4:用SSH技术和芯片技术检测到的玉米盐胁迫响应EST的同源比较及功能注释附表5:盐胁迫响应ESTs对应基因启动子区域的关键胁迫响应cis位点预测附表6:玉米盐胁迫响应zma-miRNA基因启动子区关键的胁迫响应cis元件简历致谢
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标签：玉米论文; 盐胁迫论文; 表达谱论文; 转录调控论文;
