THRSP基因对鸡脂肪沉积的影响

论文摘要

甲状腺激素应答蛋白THRSP（Thyroid Hormone Responsive Spot 14 protein）有时也被称为Spot 14。THRSP被甲状腺素和葡萄糖诱导下在肝脏、脂肪和乳腺等脂肪生成组织内特异性表达。在肝脏脂肪合成过程中对ATP柠檬酸酶、脂肪酸合成酶和苹果酸酶等脂肪合成酶基因的表达具有重要的调控作用。鸡THRSP基因家族包括THRSPα和THRSPβ两种类型,分别位于1号染色体上的chr1:184523552-184524974和chr1:184524508-184524957,二者互有重叠区域。本研究对THRSPα和THRSPβ的变异进行了检测,并分析了基因变异与生长、屠体和脂肪等经济性状的相关性;对THRSPα的不同变异情况下及组织特异性表达作了分析;还对甲状腺素对体外培养的脂肪细胞的增殖及THRSPα表达的影响作了初步探究。结果显示:1、利用DNA池结合测序方法检测到THRSPα的19个SNP中,发现位于5’侧翼区-637bp处发现的G/A单碱基突变导致THRSPα基因转录因子结合位点发生变化,增加了一个新的AP-1（activator protein 1）转录因子结合位点。统计分析结果显示,该位点的多态性与屠体重、半净膛重、全净膛重、腿肉重、脂肪带宽和腿肌粗脂肪含量等性状相关,而GG型远高于AG型,差异显著（P<0.05）;AG和GG型个体腿肌粗脂肪含量也显著高于AA型（P<0.05）,GG型与AG型之间无显著差异。2、在THRSPα基因编码区267bp处存在9bp的插入/缺失突变,即5’-CATAGATGG- 3’。其多态性在杏花鸡与隐性白洛克鸡F2代全同胞（439只）和半同胞（886只）个体资源群,以及随机取样的商品肉鸡（肥大型）群体（200只）中,都体现了与脂肪性状非常显著的相关性。缺失型（BB）和杂合型（AB）个体在腹脂重、腹脂率以及脂肪带宽方面都高于插入型（AA）（P<0.05）;而且BB和AB型个体THRSPαmRNA在鸡肝脏和腹脂中的表达都远远高于AA型个体。3、THRSPα基因9bp的插入/缺失多态性在16个引进品种和地方品种中的分布各不相同。AA,AB,BB三种基因型都是以杂合AB和BB型居多,在这16个品种中,AA型个体最少,在海兰、藏鸡和莱航鸡中甚至为零。其中只有茶花、海兰、油鸡、藏鸡和杏花5个品种处于Hardy-Weinberg平衡状态。4、本实验首次对THRSPβ基因编码区内部6-12bp的插入/缺失多态性与性状相关作了分析,发现THRSPβ基因与生长和屠体性状相关（P<0.05）而与脂肪性状无关。其中BB型（缺失型）和AB的体重从出生,连续12周体重,直到屠宰重都大于AA（插入型）,尤其BB型显著大于AA型（P<0.05）,而且在屠体指标方面也是如此。5、采用荧光定量PCR对THRSPα基因在63日龄和137日龄阳山鸡的15个和17个组织中的表达作了分析。发现THRSPα基因mRNA在63日龄阳山鸡15种组织中,心、肝、脾、肾、卵巢和输卵管、肺、胸肌、腿肌和脑,都有不同程度的表达,其中以腹脂和皮脂为最高,分别是肝脏的4倍和3倍;在137日龄阳山鸡17个组织中,THRSPα也有不同程度的表达。其中腹脂中表达量最高,心脏和下丘脑次之;脾脏和小肠为最低;肝脏、肺、皮脂、卵巢、子宫、输卵管、垂体的表达为中等水平。THRSPα基因的表达并非只在肝脏和和脂肪组织表达。6、培养液中添加甲状腺素（T3）对体外培养的脂肪细胞的增殖及THRSPα基因的表达没有产生规律性的显著效应。本研究结果显示THRSPα基因在不同群体中都体现了与脂肪性状的相关性。因此可以将其内部9bp的插入/缺失突变作为与脂肪性状连锁的标记用于肉鸡的辅助选择中,从而大大加快优质鸡的选育步伐。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 第一章 THRSPΑ基因部分片断克隆及SNP 筛选
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 供试样本
• 1.1.2 主要仪器设备
• 1.1.3 所需药品、试剂及配制
• 1.1.4 主要分子生物学软件
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 鸡血基因组DNA 抽提
• 1.2.2 引物设计与目的片段PCR 扩增及产物检测
• 1.2.3 pMD-18T Vector 载体克隆及测序
• 1.2.4 THRSPα基因核苷酸序列同源性分析
• 1.2.5 SNP 筛选及分析
• 1.2.6 统计方法
• 1.2.7 单碱基突变对转录因子的影响分析
• 2 结果与分析
• 2.1 THRSPΑ基因序列克隆及其结构分析
• 2.2 THRSPΑ与THRSPΒ基因序列比较
• 2.3 THRSPΑ基因序列多态的确定
• 2.4 突变可能导致基因转录变化情况分析
• 3 讨论
• 3.1 关于鸡THRSP 结构特点及基因重复
• 3.2 关于高SNP 突变率
• 3.3 单碱基突变引起的转录因子改变产生的影响
• 第二章 THRSPΑ、Β基因多态性与性状相关分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 实验动物
• 1.1.2 主要仪器设备
• 1.1.3 主要试剂
• 1.1.4 SSCP 试剂的配制
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 鸡血基因组DNA 抽提、PCR 扩增及产物检测
• 1.2.2 引物设计与合成
• 1.2.3 SNP 多态PCR-SSCP 检测及缺失片断非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 1.2.4 高GC 含量DNA 序列的扩增
• 1.2.5 肝脏和腹脂组织样总RNA 抽提、反转录和荧光定量PCR
• 1.2.6 数据分析
• 2 结果与分析
• 2.1 THRSP 基因变异位点的基因型检测
• 2.1.1 THRSPα5’侧翼区-637 G/A 位点SSCP 检测
• 2.1.2 THRSPα、β插入、缺失
• 2.2 突变位点多态与性状的相关
• 2.2.1 THRSPα5’侧翼区 G/A 突变与性状的相关
• 2.2.2 THRSPα基因编码区96p 插入、缺失多态与性状的相关
• 2.2.3 THRSPβ基因编码区6-126p 插入、缺失多态与性状的相关
• 3 讨论
• 3.1 THRSP 多态性与经济性状的关系
• 3.3 不同品种鸡THRSPΑ基因型和基因频率
• 第三章 体内THRSPΑ基因组织特异性表达研究
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 组织样品
• 1.1.2 主要仪器设备及耗材
• 1.1.3 主要试剂及配制
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 总RNA 的提取、检测和浓度测定
• 1.2.2 总RNA 反转录RT-PCR
• 1.2.3 实时荧光定量PCR 操作
• 1.2.4 数据分析统计
• 2 结果分析
• 2.1 总RNA 提取结果
• 2.2 THRSP 基因实时荧光定量结果及差异表达分析
• 2.2.1 定量PCR 的特异性及扩增曲线样本的重复性
• 2.2.2 基因表达定量结果
• 3 讨论
• 第四章 甲状腺素刺激对鸡脂肪细胞增殖和THRSPΑ基因表达的影响
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 组织样品
• 1.1.2 所需仪器设备
• 1.1.3 所需试剂及配制
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 前脂肪细胞的分离及培养
• 1.2.2 脂肪细胞增殖实验的方案及操作步骤
• 1.2.3 脂肪细胞THRSPα基因对T3 应答实验的方案及操作步骤
• 1.2.4 脂肪细胞总 RNA 的提取
• 2 结果与分析
• 2.1 脂肪细胞形态学观察
• 2.2 脂肪细胞诱导分化
• 2.3 脂肪细胞增殖结果
• 2.4 脂肪细胞总 RNA 的提取
• 2.5 THRSPΑ在脂肪细胞中的表达情况
• 3 讨论
• 3.1 脂肪细胞的诱导分化
• 3.2 甲状腺素刺激对脂肪细胞增殖和THRSPΑ表达的影响
• 第五章 结论
• 致谢
• 参考文献
• 文献综述