论文摘要
目的：采用人脐静脉内皮细胞（Human Umbilical Vein EndothelialCells，HUVECs）与人血小板共孵育的方法从多方面（分子水平、蛋白水平）来探讨内皮细胞CD40-血小板CD154信号途径对内皮细胞表达组织因子（tissue factor，TF）和其抑制物（tissue factor pathwayinhibitor，TFPI）的影响。方法：从正常人外周血中通过密度梯度离心的方法分离血小板，用ADP诱导血小板活化，并通过流式细胞术（FCM）检测血小板活化前后CD154表达的变化。同时将静息或ADP诱导活化的血小板分别作用于培养的脐静脉内皮细胞，以未经刺激的HUVECs作为阴性对照，LPS（5μg／ml）刺激的HUVECs作为阳性对照。采用RT-PCR及流式细胞术（FCM）等方法检测脐静脉内皮细胞TF和TFPI的表达。另外，为了验证血小板CD154-内皮细胞CD40之间的相互作用对TF和TFPI表达的影响，本实验分别在血小板与内皮细胞共同培养前加入CD154单抗或者CD40单抗以阻断活化血小板CD154或内皮细胞CD40的作用。所有的数据采用SPSS13.0进行分析。结果：①血小板与ADP作用后，血小板表面CD154的表达明显升高，同对照组相比差异有显著性（t=11.1，P＜0.01）。②经ADP活化的血小板与HUVECs共孵育后，HUVECs表达TF mRNA（t=32.3，P＜0.01）以及膜表面蛋白都显著增高（t=13.76，P＜0.01）；而且特异性CD40（F=124.415，P＜0.01）或CD154（F=144.134，P＜0.01）单克隆抗体能部分阻断上述作用，其分别和活化血小板组以及阴性对照组比较，三者之间有统计学差异；静息血小板（t=2.27，P=0.08）或单纯ADP（t=0.23，P=0.83）对HUVECs表达TF没有影响。③不同状态血小板和应用CD40或CD154单克隆抗体以及单纯ADP均不影响HUVECs TFPI的表达（F=1.36，P=0.295）。结论：①体外诱导血小板活化可使其表面表达CD154，静息血小板表达极低，因此CD154可作为血小板活化标志物之一。②活化血小板通过CD40-CD154信号通路可诱导HUVECs表达TF，而且，该效应能被CD40或CD154单克隆抗体部分抑制。③血小板CD154-内皮细胞CD40信号途经对TFPI的表达无影响。由此推测活化血小板可能通过自身表达的CD154与内皮细胞CD40相互作用介导外源性凝血途径激活，从而参与动脉粥样硬化斑块破裂和血栓形成。