肝癌转移相关的蛋白质组学研究

论文摘要

本博士论文工作的主要贡献为：采用细胞核分离技术与表达蛋白质组技术，建立了c57小鼠肝细胞核的全蛋白表达谱数据库，其中包括1193个非冗余蛋白，为其中部分定位不明的蛋白提供了细胞内定位的信息，为研究正常肝的功能提供了依据，同时也为肝病时蛋白整体变化的研究提供了参照系。随后，应用分步提取等预分离技术与双相凝胶电泳和多维色谱技术的结合，建立了肝癌高转移裸鼠模型LCI-D20的蛋白质表达谱数据库，其中发现了多个蛋白参与多种与肝癌和转移相关的通路，如ras-通路，MAPK通路等，为系统研究肝癌转移提供了宝贵数据。同时根据实验数据比较了各条实验路线的特点，为今后的研究工作打下基础。最后将亚细胞蛋白质组技术和比较蛋白质组学方法相结合，研究了不同转移潜能肝癌细胞系核蛋白的差异蛋白质组，得到了一组肝癌转移相关蛋白，包括hnRNP蛋白，ASF-2等等，并对hnRNP蛋白表达差异进行了验证。这些工作，为研究肝癌转移的机理提供了重要的数据。肝癌是诊治困难、预后极差的一种恶性肿瘤，全球肝癌发病率、病死率均位居前列，转移复发是影响肝癌术后生存的最大障碍。肝癌的发生发展以及转移复发均是多因素参与的多环节的病理过程，传统的单基因研究模式限制了肝癌相关因素的研究发展。近年来迅速发展的蛋白质组学研究，具有观察由多基因事件引起的多蛋白质组分整体变化的独特优势，更接近生命现象的本质，能动态、整体、定量地考察疾病发生发展过程中全部蛋白质种类和数量的变化，对于探讨疾病机理、寻找疾病诊断的特异标志物和药物治疗的靶标来说，是一种有效的高通量的研究模式，可获得一些传统手段无法得到的新蛋白标志物和关键分子，极大地丰富诊断标志物的选择组合，并有助于复杂致病机理的全面阐明，目前已被广泛用于研究各种疾病的发生、发展规律，并取得了很多重大的成就。本论文工作是在复旦大学生物医学研究院和复旦大学中山医院肝癌研究所已有工作的基础上进行的。首先建立了正常小鼠C57肝细胞核的蛋白质表达数据库，为肝病的研究提供了参考。然后对高转移性肝癌裸鼠模型（LCI-D20）进行了全表达谱研究，为全面深刻的理解肝癌转移的生理过程提供了大量实验数据和理论支持。最后通过对不同转移潜能肝癌细胞系核蛋白的蛋白质组表达谱进行差异分析，筛出一些有潜在应用价值的差异蛋白，包括核基质蛋白，DNA／RNA结合蛋白，hnRNP蛋白，延长因子以及代谢相关蛋白，并对其中几个hnRNP家族蛋白进行了验证。本论文由四部分组成。第一章绪论首先概述了蛋白质组学作为一门新兴学科，它的发展现状和最新的技术进展，包括双相凝胶电泳技术，生物质谱技术，色谱分离技术，蛋白质芯片技术，酵母双杂交技术和串联亲和纯化技术等。然后概述了肝蛋白质组研究的进展，提出本课题工作的研究方向。第二章所述工作采用双相凝胶电泳和质谱联用技术研究了纯化的C57小鼠核蛋白的全表达谱。首先通过多次密度梯度离心分离得到纯化的细胞核，通过电镜照片和western-blot等方法验证，证实了细胞核纯度达到90％以上，保证了后续工作的意义。对提取的核蛋白分别应用非线性pH3～10，和线性pH4～7，长24cm的固定pH梯度的IPG胶条和12.5％的SDS-PAGE进行双相凝胶电泳分离总蛋白，得到的凝胶分别进行了银染和考马斯亮兰染色。将所有胶上蛋白点切下进行胶内酶解，质谱鉴定。本工作成功鉴定了1193个鼠肝核蛋白，其中包括一些细胞定位不明的蛋白（40％），本工作为这些蛋白提供了可能的细胞定位。第二大类蛋白即为核蛋白（20％），其它一些蛋白以前未被定位于细胞核的，本实验的数据说明它们有可能共定位于细胞核。其中发现了很多DNA／RNA结合蛋白，参与核酸的调控和修饰等。在鉴定蛋白的同时，对鉴定结果进行了分析，发现了一些PMF和串级质谱进行鉴定的矛盾信息，通过对这些信息的分析，一方面存在一些可能的蛋白质翻译后修饰，另一方面也提示了目前检索条件可能引入假阳性鉴定的不足，提示我们在未来的研究工作中，若想得到高准确的鉴定，需要适当提高鉴定标准。第三章所述工作研究高转移潜能的肝癌裸鼠模型LCI-D20的全蛋白表达谱。对组织蛋白进行一步提取和顺序提取，得到的组分Totle，E1，E2和E3分别用双相凝胶电泳和多维液相色谱方法分离，然后进行质谱鉴定。共有995个非冗余蛋白得到鉴定，其中发现了很多肝癌及肝癌转移相关蛋白，包括常见的或文献报道过的肝癌或转移相关蛋白，如甲胎蛋白，ras蛋白，热休克蛋白27，MAPK蛋白等等；涉及了肝癌转移的多个过程，如代谢，细胞运动和侵袭，信号转导等，为全面、深刻的理解肝癌转移这一复杂过程提供了丰富的数据。同时通过这一工作我们比较了各种分离技术以及蛋白提取方法。结果发现，根据蛋白质疏水性不同进行的顺序提取可以大大增加蛋白的鉴定，而基于双相凝胶电泳和液相色谱的分离手段则各有优势，互为补充。基于液相色谱的分离可以避免对极端分子量和等电点蛋白的歧视，而双相电泳分离则为蛋白异构体的鉴定提供了可能。本工作首次建立了HCC转移模型LCI-D20的蛋白质组数据库，其中包含995个非冗余的蛋白，这一数据库对肝癌转移相关研究具有很高的价值。第四章所述研究工作将亚细胞蛋白质组技术和比较蛋白质组技术相结合，研究了不同转移潜能的肝癌细胞系（Hep 3B，MHCC97-L，LM3）细胞核蛋白质组的表达差异。首先建立了从细胞中分离纯化细胞核并提取核蛋白的方法。选择不同转移潜能的三个细胞系：Hep3B（肝癌不转移），MHCC97-L（肝癌低转移潜能），LM3（肝癌高转移潜能），提取细胞中的核蛋白。应用非线性pH3～10，长18cm的固定pH梯度的IPG胶条和12.5％的SDS-PAGE进行双相凝胶电泳分离总蛋白，每一例样本均分别进行3次双相电泳以保证重复性，用Image Master软件对两组的全蛋白质组表达谱进行差异分析，总共发现142个差异蛋白点（3倍以上差异）。对差异蛋白进行了胶内酶解，肽段用MALDI-TOF／TOF质谱分析，数据送入NCBI非冗余数据库，通过MASCOT搜索引擎检索。最后93个差异蛋白得到成功鉴定。研究中发现转移发生相关的蛋白和转移潜能变化相关的蛋白是互有交盖但并不完全相同的，这提示肝癌转移的发生和发展是相关的，但有区别的过程。发现的蛋白包括核基质蛋白，DNA／RNA结合蛋白，hnRNP蛋白，延长因子以及代谢相关蛋白。多数蛋白定位于细胞核，表明了细胞核分离的成功。并且用western blot验证了hnRNPA2／B1，hnRNP H，和hnRNPC1／C2的表达差异，并用细胞免疫组化研究了它们的细胞定位。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 一.研究背景
• 1.1 蛋白质组学概述及其研究进展
• 1.2 肝癌和肝癌转移研究综述
• 1.3 本论文研究基础
• 1.4 结语
• 二.本论文选题目的、意义和创新点
• 2.1 正常C57小鼠肝细胞核的蛋白质组表达谱研究
• 2.2 高转移潜能人肝癌裸鼠模型LCI-D20的蛋白质组表达谱研究
• 2.3 不同转移潜能人肝癌细胞系的比较蛋白质组学研究
• 三.参考文献
• 第二章 C57小鼠细胞核的蛋白质组表达谱研究
• 一.研究背景
• 二.实验路线
• 2.1 实验材料:
• 2.2 实验步骤
• 三.结果与讨论
• 3.1 细胞核的纯度和得率
• 3.2 蛋白纯化效果
• 3.3 双相凝胶电泳结合质谱技术鉴定C57小鼠细胞核蛋白质组表达谱
• 3.4 质谱数据的分析
• 3.5 鉴定蛋白的分析
• 四.结论
• 五.参考文献
• 六.致谢
• 第三章 人肝癌高转移裸鼠模型LCI-D20的蛋白质组表达谱研究
• 一.研究背景
• 二.实验部分
• 2.1 材料和试剂
• 2.2 动物模型和样品处理
• 2.3 双相凝胶电泳（2-DE）
• 2.4 胶内酶解和质谱鉴定
• 2.5 溶液酶解
• 2.6 强阳离子交换-反相液相色谱（SCX-RPLC）分离
• 2.7 液相分离的质谱鉴定
• 2.8 鉴定蛋白的分类
• 三.结果和讨论
• 3.1 LCI-D20蛋白质组表达谱的建立
• 3.2 不同策略联用以使更多蛋白得到鉴定
• 3.3 蛋白异构体
• 3.4 鉴定蛋白的功能分类和描述
• 四.结论
• 五.参考文献
• 六.致谢
• 第四章 不同转移潜能的人肝癌细胞系细胞核蛋白的表达差异研究
• 一.研究背景
• 二.实验部分
• 2.1 试剂与材料
• 2.2 细胞核组分的分离
• 2.3 细胞蛋白质的提取与定量分析
• 2.4 双相凝胶电泳分离
• 2.5 凝胶染色和图像采集分析
• 2.6 蛋白质胶内酶解
• 2.7 MALDI-TOF-TOF MS鉴定
• 2.8 免疫印迹
• 2.9 细胞免疫组化检测hnRNP的细胞内定位
• 三.结果与讨论
• 3.1 分离细胞核的完整性和纯度
• 3.2 Hep3B,MHCC97-L,和LM3核蛋白的双相凝胶电泳差异图谱和差异蛋白的鉴定
• 3.3 鉴定蛋白的分类和功能讨论
• 3.4 hnRNP蛋白表达差异的验证和细胞定位实验
• 四.结论
• 五.参考文献
• 在学期间发表论文
• 研究论文:
• 会议论文:
• 致谢
• 附表