多肽淀粉样纤维与细胞膜之间的相互作用

论文摘要

蛋白质淀粉样纤维是造成多种人类疾病的因素之一,如Alzheimer’s disease（AD）是由神经元中β淀粉样肽的沉积所致。目前已知淀粉样纤维具有细胞毒性,可导致人红细胞的溶血,但具体作用机制不清。为进一步了解淀粉样纤维的细胞毒性作用,探究其作用机制,本实验以红细胞作为细胞膜模型,研究了胰岛素淀粉样纤维及β淀粉样肽的一段特征性序列Aβ25-35与红细胞之间的相互作用,分析淀粉样纤维引起的细胞溶血,对细胞形态,细胞膜骨架,以及细胞膜流动性的影响;以Aβ25-35对红细胞的损伤为模型,研究了一定剂量γ射线的照射对此损伤作用的影响。实验的主要方法和结果:一、胰岛素淀粉样纤维对红细胞的影响1.胰岛素淀粉样纤维对红细胞渗透脆性的影响将一定量的胰岛素纤维作用后的红细胞置于渗透压梯度的缓冲溶液中,采用分光光度计检测溶血率,并绘制红细胞膜渗透脆性曲线,发现胰岛素淀粉样纤维改变了细胞膜的渗透脆性。2.胰岛素纤维在孵育过程中巯基暴露趋势与其细胞毒性的关系研究在胰岛素淀粉样纤维的孵育过程中的不同时段取样,同时检测其溶血效果和巯基暴露的程度。结果发现胰岛素纤维孵育3小时后溶血效应开始增强,4.5至7.5小时之间溶血效应最强,之后开始下降,孵育9小时后溶血效果不再随时间变化。比较溶血与巯基暴露的时间曲线发现,胰岛素巯基开始暴露时的纤维其溶血效果最强,但之后巯基继续暴露并不能增加其溶血效应。二、Aβ淀粉样肽对红细胞的影响1.Aβ25-35的溶血效应红细胞经孵育不同时间后的Aβ25-35处理后,检测溶血率变化趋势,结果显示在前40分钟随着Aβ25-35孵育时间延长,溶血率上升;在40分钟后则下降。红细胞经不同终浓度Aβ25-35处理后检测溶血率,发现溶血率随着的Aβ25-35浓度上升而提高。2.Aβ25-35对红细胞膜形态及膜骨架蛋白的影响红细胞经一定浓度的Aβ25-35处理后,于扫描电镜下观察,可见红细胞发生轻微聚集,并有部分红细胞出现棘突,细胞形态发生改变。提取红细胞血影并用一定浓度的Aβ25-35处理后,使用原子力显微镜观察。发现与对照组相比,Aβ25-35作用后的红细胞血影,规则的网格状结构丢失,表明膜表面骨架蛋白的分布受到影响。3.Aβ25-35对红细胞流动性的影响使用DPH作为荧光探针,插入细胞膜的磷脂双层并稳定后,通过探针的各相异性值检测细胞膜的流动性变化。发现Aβ25-35处理过后的红细胞与对照组细胞膜的流动性并无明显差别。结果显示,Aβ25-35对细胞膜的损伤不是膜脂流动性的变化所引发。三、γ射线对Aβ25-35诱导的红细胞损伤的影响本研究应用两种不同剂量（50 Gy,100 Gy）的γ射线,对Aβ25-35与红细胞的相互作用进行了研究,结果发现,两种剂量的γ射线照射均对Aβ25-35导致的红细胞损伤具有保护作用。1.溶血率测定当Aβ25-35作用于经不同剂量γ射线照射后的红细胞时,溶血效应与未经照射的红细胞相比明显减弱,说明γ射线对Aβ25-35诱导溶血作用具有抑制作用。2.红细胞的形态变化γ射线照射后的红细胞经Aβ25-35处理后,仍维持良好的细胞形态,呈正常的双凹圆盘形,表明γ射线有助于维持红细胞的正常形态。3.红细胞渗透脆性的变化将γ射线照射后的红细胞置于渗透压改变的梯度缓冲液中,采用分光光度计检测溶血率发现,γ射线照射后,红细胞对低渗溶液的耐受性有所提高。4.红细胞膜脂流动性的改变γ射线照射后的红细胞加入一定剂量的Aβ25-35后孵育,使用DPH作为荧光探针,检测膜流动性。实验发现,γ射线照射后红细胞的膜流动性增强。结论:胰岛素纤维与Aβ25-35均会对红细胞膜造成损伤,导致细胞溶血。在一定时间内,淀粉样纤维随着孵育时间的延长,溶血作用也得到增强,之后则呈现减弱,说明两种淀粉样纤维的细胞毒性作用均与其结构变化有密切关系,并且Aβ25-35更易形成淀粉样纤维。胰岛素纤孵育过程中观察到自由巯基的暴露,胰岛素纤维的自由巯基能够和膜骨架相关蛋白的巯基交换,这可能与其溶血作用相关;Aβ25-35导致了膜下骨架蛋白的变化,而磷脂层的流动性则不受影响,表明Aβ25-35对红细胞的损伤涉及到Aβ25-35与膜下骨架蛋白的相互作用。在本文的实验条件下,γ射线对Aβ25-35诱导的红细胞损伤具有保护作用,并且增加了细胞膜的流动性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 引言
• 1.1 淀粉样纤维及其相关疾病简介
• 1.1.1 淀粉样纤维的结构和成因
• 1.1.2 淀粉样纤维的相关疾病
• 1.2 胰岛素淀粉样纤维
• 1.2.1 胰岛素简介
• 1.2.2 胰岛素淀粉样纤维的形成及特性
• 1.2.3 胰岛素淀粉样纤维的毒性
• 1.3 β淀粉样肽
• 1.3.1 β淀粉样肽的简介
• 1.3.2 β淀粉样肽与阿兹海默氏疾病
• 1.3.3 β淀粉样肽的细胞毒性
• 1.4 红细胞
• 1.4.1 红细胞的结构和功能
• 1.4.2 红细胞膜的组成
• 1.4.3 红细胞膜骨架
• 1.4.4 红细胞血影
• 1.5 γ射线简介
• 1.5.1 γ射线的产生和特性
• 1.5.2 γ射线的生物学效应
• 1.5.3 γ射线对红细胞膜的作用
• 1.6 结束语
• 第2章 胰岛素淀粉样纤维与红细胞膜的作用
• 2.1 材料和试剂
• 2.1.1 材料和药品
• 2.1.2 溶液及配制
• 2.2 实验仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 红细胞的分离
• 2.3.2 胰岛素纤维的制备
• 2.3.3 ThT荧光检测
• 2.3.4 不同孵育时间的胰岛素淀粉样纤维诱导的红细胞溶血
• 2.3.5 胰岛素纤维自由巯基的测定
• 2.3.6 红细胞渗透脆性曲线测定
• 2.4 实验结果
• 2.4.1 胰岛素纤维生长的ThT检测
• 2.4.2 胰岛素纤维的溶血效应
• 2.4.3 胰岛素孵育过程中巯基的暴露情况
• 2.4.4 胰岛素纤维对红细胞渗透脆性的影响
• 2.5 讨论
• 2.5.1 胰岛素淀粉样纤维的对红细胞的溶血效应
• 2.5.2 胰岛素淀粉样纤维的溶血效应与纤维结构的关系
• 第3章 β淀粉样肽与红细胞膜的相互作用
• 3.1 材料和试剂
• 3.1.1 材料和药品
• 3.1.2 溶液及配制
• 3.2 实验仪器
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 红细胞的分离
• 3.3.2 红细胞血影的制备
• 25-35诱导红细胞溶血的测定'>3.3.3 不同浓度Aβ_25-35诱导红细胞溶血的测定
• 25-35诱导红细胞溶血的测定'>3.3.4 不同孵育时间的Aβ_25-35诱导红细胞溶血的测定
• 3.3.5 红细胞形态的电子扫描显微镜观察
• 3.3.6 红细胞血影的AFM观察
• 3.3.7 溶菌酶纤维处理红细胞
• 3.3.8 红细胞膜脂质流动性检测
• 3.4 实验结果
• 25-35导致的红细胞溶血'>3.4.1 Aβ_25-35导致的红细胞溶血
• 25-35导致的红细胞形态变化'>3.4.2 Aβ_25-35导致的红细胞形态变化
• 25-35对红细胞血影的作用'>3.4.3 Aβ_25-35对红细胞血影的作用
• 25-35对红细胞膜流动性的影响'>3.4.4 Aβ_25-35对红细胞膜流动性的影响
• 3.4.5 溶菌酶纤维对红细胞膜流动性的影响
• 3.5 讨论
• 25-35对红细胞的损伤作用'>3.5.1 Aβ_25-35对红细胞的损伤作用
• 25-35对细胞膜的作用机制'>3.5.2 Aβ_25-35对细胞膜的作用机制
• 25-35与红细胞相互作用的影响'>第4章 γ射线对Aβ_25-35与红细胞相互作用的影响
• 4.1 材料和试剂
• 4.1.1 材料和药品
• 4.1.2 溶液及配制
• 4.2 实验仪器
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 红细胞的分离
• 4.3.2 γ射线照射红细胞
• 4.3.3 红细胞渗透脆性曲线测定
• 4.3.4 扫描电镜观察红细胞形态
• 4.3.5 红细胞膜脂质流动性检测
• 4.4 实验结果
• 25₃5溶血作用的影响'>4.4.1 γ射线对Aβ₂₅₃₅溶血作用的影响
• 25-35作用于红细胞形态'>4.4.2 γ射线辐照后Aβ_25-35作用于红细胞形态
• 4.4.3 γ射线对红细胞渗透脆性的影响
• 4.4.4 γ射线对红细胞膜流动性的影响
• 4.5 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间的研究成果