胍基化聚乙烯亚胺非病毒转基因载体

论文摘要

跨膜屏障是非病毒转基因载体在基因转染中面临的主要障碍。为了设计一种可有效跨越细胞膜屏障的转基因载体,本文将胍基引入支化聚乙烯亚胺,制备了胍基化聚乙烯亚胺非病毒载体。琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭（EB）置换实验表明胍基化聚乙烯亚胺可有效复合DNA,但在一定程度上削弱了载体和DNA之间的相互作用。透射电镜下,胍基化聚乙烯亚胺/DNA复合物呈球状分散粒子,且当复合比大于临界复合比时,其粒径均小于150纳米。Zeta电位实验表明胍基化聚乙烯亚胺/DNA复合物表面带正电荷,且胍基化后载体的Zeta电位有所降低。以荧光素酶为报告基因考察胍基化聚乙烯亚胺载体对非洲绿猴肾（COS-7）细胞的基因转染,结果表明与未改性聚乙烯亚胺相比,胍基化聚乙烯亚胺有着更高的转染效率和更低的细胞毒性。药物抑制实验揭示,凹陷蛋白介导的细胞内吞作用对胍基化聚乙烯亚胺载体的高效表达起关键作用。同时,利用反式环己二醇所具有的非特异性打开核孔的独特作用,将反式环己二醇与胍基化载体体系相结合,结果显示载体效率有了进一步的提高,预示其应用于非分裂细胞的基因转染的可行性。鉴于这些特点,胍基化聚乙烯亚胺有望成为高效低毒的非病毒载体而应用于体内转基因应用中。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 引言
• 1.2 非病毒转基因载体
• 1.2.1 裸DNA
• 1.2.2 脂质体/DNA复合物
• 1.2.3 阳离子高聚物/DNA复合物
• 1.3 非病毒转基因载体/DNA复合物的转运递送过程
• 1.3.1 细胞外环境中的稳定性
• 1.3.2 细胞摄取
• 1.3.3 从内涵体到溶酶体的逃逸
• 1.3.4 质粒DNA在胞浆中的运输
• 1.3.5 质粒DNA入核
• 1.4 富含精氨酸的细胞穿膜肽
• 1.4.1 细胞穿膜肽概述
• 1.4.2 富含精氨酸的细胞穿膜肽
• 1.5 论文工作的提出
• 第二章 胍基化聚乙烯亚胺载体的制备和表征
• 2.1 实验部分
• 2.1.1 实验原料
• 2.1.2 胍基化聚乙烯亚胺载体的制备
• 2.1.3 胍基化聚乙烯亚胺载体的表征
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 核磁共振谱图分析
• 2.2.2 胍基化PEI载体的取代度分析
• 2.3 本章小结
• 第三章 胍基化聚乙烯亚胺/pDNA复合物的研究
• 3.1 实验部分
• 3.1.1 试剂耗材
• 3.1.2 实验仪器
• 3.1.3 菌体的培养和质粒的提取
• 3.1.4 聚乙烯亚胺基载体/pDNA复合物的制备
• 3.1.5 琼脂糖凝胶电泳
• 3.1.6 EB置换实验
• 3.1.7 透射电镜（TEM）
• 3.1.8 Zeta电位检测
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 凝胶电泳考察PEI基载体与pDNA的复合
• 3.2.2 EB置换实验考察PEI基载体与pDNA的复合
• 3.2.3 TEM考察复合物的形态和尺寸
• 3.2.4 复合物的Zeta电位分析
• 3.3 本章小结
• 第四章 胍基化聚乙烯亚胺/pDNA复合物的体外细胞转染及其跨膜机理研究
• 4.1 实验部分
• 4.1.1 试剂耗材
• 4.1.2 实验仪器
• 4.1.3 COS-7 细胞的培养
• 4.1.4 胍基化PEI载体转染效率的测定
• 4.1.5 MTT考察载体毒性
• 4.1.6 温度抑制实验
• 4.1.7 药物抑制实验
• 4.1.8 反式环己二醇（TCHD）的体外转染
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 胍基化改性可提高载体的转染效率
• 4.2.2 载体的细胞毒性分析
• 4.2.3 胍基化PEI载体跨膜机理研究
• 4.2.4 TCHD介导的体外转染
• 4.3 本章小结
• 第五章 全文结论
• 参考文献
• 发表论文和科研情况说明
• 致谢