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嗜热单孢菌角质酶的基因鉴定、高效表达及分子改造

2020-12-07阅读(968)

嗜热单孢菌角质酶的基因鉴定、高效表达及分子改造

论文摘要

角质酶是一种可以降解角质并产生大量脂肪酸单体的水解酶。角质酶是一种多功能酶,可水解可溶性酯、不溶性甘油三酯和各种聚酯,同时还能催化酸与醇的酯化、脂肪酸盐与醇的转酯化反应,因此在食品工业、化工工业等诸多领域都具有广泛的应用。近年来研究发现,角质酶可实现棉纤维的生物精练和合成纤维的生物改性,是推动纺织工业清洁生产的关键酶制剂。国外对真菌角质酶进行了深入的研究,但由于存在基因工程异源表达时表达量低和稳定性差等问题,至今没有实现工业化生产。与真菌角质酶相比,细菌角质酶具有催化效率高、基因工程异源表达技术成熟等方面的优势,但是国内外关于细菌角质酶的报道很少,迄今为止没有细菌角质酶基因鉴定的报道,因此细菌角质酶的研究受到限制。本论文完成了嗜热放线菌Thermobifida fusca角质酶的基因鉴定,实现了其在大肠杆菌中的高效表达及分子改造,主要结果如下:1.依次经过硫酸铵沉淀,Phenyl HP Sepharose FF疏水色谱,DEAE Sepharose FF阴离子交换色谱,从角质诱导的T. fusca发酵液中纯化得到电泳纯pNPB水解酶,比酶活由52.3 U/mg提高至398.6 U/mg,纯化倍数为7.6,回收率为9.3%。此外,通过硫酸铵沉淀,Phenyl HP Sepharose FF疏水色谱,CM Sepharose FF阳离子交换色谱,从重组Bacillus subtilis发酵液中纯化得到电泳纯Fusarium solani pisi角质酶。以F. solani pisi角质酶为对照品,苹果角质为底物,采用GC/MS分析,鉴定纯化得到的pNPB水解酶与F. solani pisi角质酶类似,能水解苹果角质并产生特征性产物,具有角质酶功能。2.纯化得到的T. fusca pNPB水解酶经肽指纹图谱鉴定,与数据库中Tfu0882和Tfu0883两个甘油三酯酶相符。通过N端测序得到纯化的蛋白N端前九个氨基酸为:ANPYERGPN。以T. fusca总DNA为模板,设计引物PCR得到编码Tfu0882和Tfu0883成熟蛋白的基因,并和具有PelB信号肽和6-His纯化标记的pET20b（+）质粒相连,使Tfu0882和Tfu0883在E. coli BL21（DE3）中过量表达。通过IPTG诱导,重组菌发酵上清液pNPB水解酶酶活Tfu0882为52.5 U/mL,Tfu0883为90.6 U/mL,分别是T. fusca诱导发酵液的4.37和7.56倍。采用Ni亲和柱对重组Tfu0882和Tfu0883进行分离纯化,纯化后重组蛋白达到电泳纯,重组Tfu0882和Tfu0883的pNPB水解酶比活力分别为223.1 U/mg、458.2 U/mg,并且两者均能水解角质并产生特异性产物,由此可确定,Tfu0882和Tfu0883是编码T. fusca角质酶基因。3.考察IPTG浓度和温度对重组大肠杆菌发酵生产Tfu0883的影响,发现不添加IPTG和25°C恒温培养效果较好,发酵80 h培养基中pNPB水解酶酶活达130.5 U/ml。在该条件下发酵生产Tfu0883,周质空间有大量重组蛋白积累,跨外膜转运成为重组蛋白向培养基中分泌的限速步骤。通过添加膜透性增强剂和改变环境条件加速重组Tfu0883从周质空间向培养基中分泌。研究表明,在对数生长中期,添加100 mM甘氨酸、1 mM表面活性剂TDOC均可将酶活最高点从80 h提前至54 h;采取重组大肠杆菌在25°C发酵至24 h时将培养温度提高至37°C的变温策略对重组蛋白的分泌有促进作用,酶活最高点出现于62 h,比不变温的对照提前了18 h。4.重组Tfu0882、Tfu0883和F. solani pisi角质酶在水溶液中均以单体形式存在。重组Tfu0882、Tfu0883的最适温度为60°C,并具有良好的热稳定性;重组F. solani pisi角质酶的最适温度为40°C,热稳定性较差。三种角质酶的最适pH均为8.0,pH稳定范围为6.0-9.0。三种角质酶均能够水解可溶性酯、不溶性甘油三酯和聚酯,并倾向于水解短链底物,没有位置特异性。F. solani pisi角质酶对pNPB底物的亲和力最大,催化效率最高;F. solani pisi角质酶水解PET能力最强,Tfu0883次之,Tfu0882对PET仅有微弱水解。三种角质酶都没有界面活化现象,不需要二价金属离子作为辅助因子,Mn2+对三者有激活作用,Cr2+和Hg2+对三种角质酶有强烈抑制作用。Triton X-100和Tween 20抑制Tfu0882和Tfu0883的活性,对F. solani pisi角质酶无明显作用;SDS对三种角质酶均有竞争性抑制,Tfu0882抑制最弱;TDOC对F. solani pisi角质酶有明显激活作用。重组Tfu0882和Tfu0883在甲醇、乙醇等多种有机溶剂中具有良好的稳定性,F. solani pisi角质酶在有机溶剂中的稳定性较差。5.以Streptomyces exfoliates脂肪酶晶体结构为模板,通过SWISS-MODEL软件模拟得到Tfu0883和Tfu0882结构模型。模型显示,T. fusca角质酶具有典型的α/β水解酶结构,Tfu0883的活性中心由S170-H248-D216催化三角组成,Tfu0882的活性中心由S188- H266-D234催化三角组成。T. fusca角质酶活性中心上方没有盖子结构,活性中心暴露于溶剂中。角质酶基因Tfu0882和Tfu0883在基因组中处在相邻位置,并处于两个不同的操纵子中,受到不同的调控。Tfu0882和Tfu0883在水解角质过程中没有协同作用。在结构模拟的基础上进行理性分析,并成功构建了角质酶突变体Tfu0883-I218A、Tfu0883-W195A/F249A和Tfu0883-Q132A/T101A,催化性质研究表明,突变体对小分子底物的催化没有明显影响;突变体Tfu0883-I218A和Tfu0883-Q132A/T101A水解角质能力明显提高;突变体Tfu0883-Q132A/T101A水解PET聚酯的能力也得到明显提高。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第一章 绪论
  • 1.1 角质
  • 1.1.1 角质的分布
  • 1.1.2 角质的组成及结构
  • 1.1.3 棉纤维中的角质
  • 1.2 角质酶的性质及应用
  • 1.2.1 角质酶的来源
  • 1.2.2 角质酶的理化性质
  • 1.2.3 角质酶的应用
  • 1.3 角质酶的制备及分子改造
  • 1.3.1 角质酶的基因及克隆表达
  • 1.3.2 角质酶的分子改造
  • 1.3.3 角质酶的生产
  • 1.4 本论文的主要研究内容
  • 1.4.1 立项依据及研究意义
  • 1.4.2 本论文的主要研究内容
  • 参考文献
  • 第二章 T. fusca 角质酶的分离纯化
  • 2.1 引言
  • 2.2 材料与方法
  • 2.2.1 菌株
  • 2.2.2 试剂和仪器
  • 2.2.3 培养基和培养条件
  • 2.2.4 分析方法
  • 2.2.5 T. fusca pNPB 水解酶的纯化
  • 2.2.6 F. solani pisi 角质酶的纯化
  • 2.2.7 角质的制备
  • 2.3 结果与讨论
  • 2.3.1 T. fusca 角质酶的诱导制备
  • 2.3.2 pNPB 水解酶的分离纯化
  • 2.3.3 pNPB 水解酶角质水解能力研究
  • 2.4 本章小结
  • 参考文献
  • 第三章 T. fusca角质酶基因的鉴定及克隆表达
  • 3.1 引言
  • 3.2 材料与方法
  • 3.2.1 菌株
  • 3.2.2 试剂和仪器
  • 3.2.3 培养基和培养条件
  • 3.2.4 分析方法
  • 3.2.5 肽指纹图谱测序
  • 3.2.6 N-端测序
  • 3.2.7 总DNA 的提取
  • 3.2.8 PCR 扩增目的基因
  • 3.2.9 PCR 产物回收
  • 3.2.10 载体连接
  • 3.2.11 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
  • 3.2.12 重组质粒的筛选与鉴定
  • 3.2.13 定点突变方法
  • 3.2.14 重组角质酶的纯化
  • 3.3 结果与讨论
  • 3.3.1 肽指纹图谱鉴定T. fusca 角质酶基因
  • 3.3.2 T. fusca 角质酶的N-端测序
  • 0882 和Tfu0883 基因的克隆'>3.3.3 Tfu0882 和Tfu0883 基因的克隆
  • 0882 和Tfu0883 基因在大肠杆菌中的表达'>3.3.4 Tfu0882 和Tfu0883 基因在大肠杆菌中的表达
  • 0882 和Tfu0883 的分离纯化'>3.3.5 重组Tfu0882 和Tfu0883 的分离纯化
  • 0882 和Tfu0883 角质水解能力研究'>3.3.6 重组Tfu0882 和Tfu0883 角质水解能力研究
  • 3.4 本章小结
  • 参考文献
  • 第四章 重组T.fusca角质酶的高效分泌
  • 4.1 引言
  • 4.2 材料与方法
  • 4.2.1 菌株
  • 4.2.2 试剂和仪器
  • 4.2.3 培养基和培养条件
  • 4.2.4 分析方法
  • 4.2.5 周质蛋白的释放
  • 4.3 结果与讨论
  • 0883 的发酵过程研究'>4.3.1 重组Tfu0883 的发酵过程研究
  • 0883 的影响'>4.3.2 IPTG 诱导浓度对重组大肠杆菌发酵生产重组Tfu0883 的影响
  • 0883 的影响'>4.3.3 温度对重组大肠杆菌发酵生产重组Tfu0883 的影响
  • 0883 分泌的影响'>4.3.4 甘氨酸对重组Tfu0883 分泌的影响
  • 0883 分泌的影响'>4.3.5 表面活性剂对重组Tfu0883 分泌的影响
  • 0883 分泌的影响'>4.3.6 两阶段温度控制对重组Tfu0883 分泌的影响
  • 4.4 本章小结
  • 参考文献
  • 第五章 重组T.fusca角质酶酶学性质研究
  • 5.1 引言
  • 5.2 材料与方法
  • 5.2.1 角质酶
  • 5.2.2 试剂与仪器
  • 5.2.3 分析方法
  • 5.3 结果与讨论
  • 5.3.1 角质酶分子量的测定
  • 5.3.2 重组角质酶的最适温度及温度稳定性
  • 5.3.3 重组角质酶的最适pH 及pH 稳定性
  • 5.3.4 重组角质酶的底物特异性研究
  • 5.3.5 重组角质酶的动力学分析
  • 5.3.6 重组角质酶的油-水界面特性
  • 5.3.7 金属离子对重组角质酶的影响
  • 5.3.8 表面活性剂对重组角质酶的影响
  • 5.3.9 重组角质酶在有机溶剂中的稳定性
  • 5.4 本章小结
  • 参考文献
  • 第六章 T.fusca 角质酶的催化机理初探及分子改造
  • 6.1 引言
  • 6.2 材料与方法
  • 6.2.1 菌株
  • 6.2.2 试剂与仪器
  • 6.2.3 培养基与培养条件
  • 6.2.4 分析方法
  • 6.2.5 定点突变方法
  • 6.2.6 重组质粒的筛选与鉴定
  • 6.2.7 转化大肠杆菌感受态细胞
  • 6.2.8 抑制剂对角质酶的影响
  • 6.2.9 角质酶的协同作用研究
  • 6.3 结果与讨论
  • 6.3.1 重组T. fusca 角质酶的结构模拟
  • 0882 和Tfu0883 催化角质水解机理初探'>6.3.2 Tfu0882 和Tfu0883 催化角质水解机理初探
  • 0883 的分子改造'>6.3.3 Tfu0883 的分子改造
  • 6.4 本章小结
  • 6.5 参考文献
  • 结论
  • 致谢
  • 附录：作者在攻读博士学位期间发表的论文

    • 相关论文文献

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