结核分枝杆菌螺旋酶A、B亚基相互作用的研究

论文摘要

DNA拓扑酶广泛存在于生物体细胞核内,参与了细胞内几乎所有的DNA活动,如DNA的复制、转录和基因重组、染色质的重组以及其它的细胞生理过程。DNA螺旋酶是拓扑异构酶中唯一一种能引入负超螺旋的酶,对细菌的转录、复制等生理功能是必需的,而人类不存在这种酶,因此螺旋酶是一个成功的抗菌药物靶标。同时,细菌对喹诺酮类的抗性是由于GyrA,GyrB的突变引起的。DNA螺旋酶是由A,B亚基组成的二源四聚体,单个的A、B亚基不具有任何催化活性,二者必须发生相互作用而重组后,才具有酶催化活性。目前为止,结核分枝杆菌螺旋酶GyrA、GyrB亚基相互作用的研究并不深入,只知道GyrB的碳端是与GyrA产生相互作用的功能结构域。本研究旨在确定结核分枝杆菌螺旋酶GyrA和GyrB亚基产生相互作用的功能结构域,主要结果如下:1.将gyrB从碳端截短,成功构建了一系列碳端不同程度的缺失体,包括gyrB1-462、gyrB1-564、gyrB1-631、gyrB1-663、gyrB1-690和gyrB,将这些片段连入酵母诱饵载体,同时将gyrA完整基因连入酵母捕获载体,进行酵母双杂交试验。研究结果表明,GyrB1-564、GyrB1-631、GyrB1-663、GyrB1-690、GyrB蛋白与GyrA在激活报告基因组氨酸和β-半乳糖苷酶表达中呈阳性反应,即GyrB1-564、GyrB1-631、GyrB1-663、GyrB1-690、GyrB蛋白与GyrA存在相互作用,而GyrB1-462与GyrA没有相互作用,因此,GyrB与GyrA相互作用的区域在GyrB的第463到564个氨基酸之间。2.将gyrB从氮端截短,成功构建了一系列氮端不同程度的缺失体,包括gyrB105-714、gyrB278-714、gyrB376-714和gyrB463-714,将这些片段连入酵母诱饵载体,同时将gyrA完整基因连入酵母捕获载体,进行酵母双杂交试验。研究结果表明,GyrB105-714、GyrB278-714、GyrB376-714、GyrB463-714蛋白与GyrA在激活报告基因组氨酸表达中呈阳性反应,但是在激活报告基因β-半乳糖苷酶表达中呈阴性反应。因为β-半乳糖苷酶报告基因的筛选比组氨酸报告基因的筛选更为严谨,推测可能是因为GyrB的氮端截短造成了GyrB与GyrA亚基相互作用的区域463-564个氨基酸之间蛋白构象的改变,从而使某些重要相互作用位点被堵塞而使得相互作用减弱,所以在激活报告基因β-半乳糖苷酶表达中呈阴性反应。3.因为Toprim结构域包含了GyrB463-564,所以通过重叠PCR缺失GyrB的Toprim结构域,构建gyrB缺失Toprim结构域的突变体gyrB△T,然后进行酵母双杂交试验,试验结果得出GyrB△T与GyrA在激活报告基因组氨酸和β-半乳糖苷酶表达中呈阴性反应,表明GyrB蛋白缺失Toprim结构域的突变体与GyrA没有相互作用,从而验证了前期的试验结论,并且能推断出Toprim结构域是GyrA、GyrB亚基产生相互作用的关键结构域。4.成功构建了gyrA、gyrB、gyrB1-564、gyrB1-631、gyrB1-631、gyrB△T、gyrB463-714的表达载体,进行了蛋白质的诱导表达和纯化,为测定酶活和进行SPR验证试验提供了材料基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 我国结核病现状
• 1.2 DNA螺旋酶在结核病防治中的重要作用
• 1.3 DNA拓扑异构酶研究进展
• 1.3.1 DNA拓扑异构酶的分类
• 1.3.2 DNA拓扑异构酶的功能
• 1.3.3 DNA螺旋酶的功能结构域
• 1.3.4 DNA螺旋酶的作用机理
• 1.4 蛋白质相互作用研究进展
• 1.4.1 酵母双杂交
• 1.4.2 免疫共沉淀
• 1.4.3 噬菌体展示
• 1.4.4 Pull down
• 1.4.5 表面等离子共振
• 1.4.6 荧光共振能量转移
• 1.4.7 石英晶体微天平
• 2 研究目的与意义
• 3 材料与方法
• 3.1 材料
• 3.1.1 培养基
• 3.1.2 质粒与菌株
• 3.1.3 各种分子生物学酶、试剂盒及常用试剂
• 3.2 方法
• 3.2.1 结核分枝杆菌螺旋酶基因及其片段的PCR扩增与鉴定
• 3.2.2 gyrA基因和gyrB基因片段PCR产物的回收纯化与克隆
• 3.2.3 酵母双杂交试验
• 3.2.4 蛋白质表达
• 4 结果与分析
• 4.1 GYRA基因GYRB基因及其片段克隆到酵母载体
• 4.2 靶基因GYRA和GYRB在酵母菌中自激活报告基因的检测
• 4.3 螺旋酶B亚基C端系列缺失突变体与A亚基的相互作用
• 4.4 螺旋酶B亚基N端系列缺失突变体与A亚基的相互作用
• 4.5 螺旋酶B亚基TOPRIM域缺失突变体与A亚基的相互作用
• 4.6 螺旋酶B亚基及其突变体与A亚基的蛋白表达和纯化
• 4.6.1 表达载体的构建
• 4.6.2 蛋白质的表达与纯化
• 5 讨论
• 6 结论
• 参考文献
• 致谢