论文题目: 小麦抗逆相关DREB/ERF转录因子基因的克隆与鉴定
论文类型: 博士论文
论文专业: 作物遗传育种
作者: 徐兆师
导师: 马有志
关键词: 小麦,转录因子,基因调控,胁迫响应,胁迫耐性
文献来源: 中国农业科学院
发表年度: 2005
论文摘要: 植物能感知、传递逆境胁迫信号,诱导相关功能的基因表达,在生理生化上作出适应性响应。转录因子在信号的传递、相关功能基因的表达调控以及发育阶段的调控中起着重要的作用。Sakuma等人将拟南芥中的145个AP2/EREBP转录因子分成5类:AP2类(14 genes),RAV类(6 genes),DREB类(即CBF,56 genes),ERF类(即EREBP,65 genes)和其它(4 genes)。其中,DREB和ERF类转录因子可能参与了生物胁迫和非生物胁迫响应。 DRE/CRT元件位于受干旱或低温调控的RD/COR(responsive to dehydration/cold-regulated)基因的启动子区,DREB转录因子通过结合DRE/CRT元件参与非生物胁迫响应;ERE元件位于抗病相关PR(pathogenesis-related)基因的启动子区,ERF转录因子可能通过与ERE元件的互作参与抗病性响应。 近年来,AP2/EREBP转录因子倍受重视,研究表明,DREB和ERF类转录因子可以用于改良农作物对生物胁迫和非生物胁迫的耐性。本实验旨在利用酵母单杂交和噬菌斑原位杂交的方法,克隆与抗逆相关的转录因子基因,并通过转基因技术获得小麦抗逆材料。对于小麦的抗逆育种以及阐述小麦耐受胁迫的分子机制都有着重要的意义。 本研究取得以下研究进展: 1.cDNA文库的构建:采用抗旱品种小白麦和耐盐品种茶淀红分别构建了小麦干旱诱导和高盐诱导的cDNA噬菌体文库,容量分别为3.6×10~6 pfu和3.0×10~6 pfu,插入片段大小多集中在0.7-2kb之间。 2.目的基因的克隆:用DREB/ERF转录因子保守域AP2片段做探针,采用噬菌体原位杂交技术筛选干旱诱导的小麦cDNA噬菌体文库,结合5’-RACE和RT-PCR的方法共克隆到10个DREB类转录因子基因(DREB2-11)和2个ERF类转录因子基因(ERF1-2)。根据氨基酸序列的同源性和序列的结构特征,将克隆到的10个DREB(DREB2-DREB11)基因分成5类,第Ⅰ类:DREB3、DREB4和DREB5;第Ⅱ类:W50、DREB6和DREB7与DREB1(Shen et al., 2003);第Ⅲ类:DREB2和DREB8;第Ⅳ类:DREB9和DREB10;第Ⅴ类:DREB11;ERF1和ERF2分别属于不同的两类基因,除了第Ⅱ类DREB基因外,其余均为未见报道的新基因。 3.基因结构分析:分析了克隆到的10个DREB和ERF基因(除DREB2和DREB8)的结构,结果表明,除了ERF2基因不含内含子外,其余9个基因(DREB3-7,DREB9-11和ERF1)均含有1-3个内含子。有趣的是,DREB4 cDNA序列对应两个不同形式的基因结构,一个大小1.2Kb左右,不含内含子,对应DREB4B cDNA序列,另一个大小3.5Kb左右,有4个外显子和3个内含子组成,推测可能存在3种不同的剪辑方式从而形成了3种不同的cDNA: DREB4A、DREB4B和DREB4C。 4.表达特性分析:Northern blot试验结果表明DREB4基因的转录依赖于ABA,受干旱、高盐的诱导,低温也微弱地激活了DREB4基因的转录表达;ERF1基因受干旱和低温的强烈诱导,对ABA有微弱的响应,而ERF2基因的转录受干旱和高盐的强烈诱导,外源ABA在早期也
论文目录:
第一章 引言
1 植物在非生物胁迫下诱导表达的基因
1.1 在逆境胁迫中直接发挥功能的蛋白
1.2 感应和传导胁迫信号的蛋白激酶
1.3 调控基因表达的转录因子
1.4 下调控基因
2 植物对逆境胁迫应答的信号传导途径
2.1 不依赖于Ca~(2+)的MAPK信号路径
2.2 依赖于Ca~(2+)的CDPK信号路径
2.3 依赖于Ca~(2+)的SOS信号路径
3 植物在逆境胁迫下的基因表达调控
3.1 转录水平下植物逆境胁迫应答基因的表达调控
3.2 转录后水平的调控
3.3 植物胁迫响应基因表达网络的复杂性：既具有特异性，又相互协调
4 抗逆相关转录因子的研究现状
4.1 AP2／EREBP转录因子
4.2 bZIP类转录因子
4.3 MYB／MYC转录因子
5 植物抗逆基因工程研究进展
5.1 渗透调节物质合成的关键酶
5.2 抗氧化系统酶类基因
5.3 LEA类蛋白
5.4 转录因子及信号传导有关的蛋白激酶
6 立题意义、依据及技术路线
6.1 立题意义、依据
6.2 技术路线
第二章 小麦干旱诱导cDNA噬菌体文库的构建与筛选
1 材料与方法
1.1 材料
1.2 方法
1.2.1 小麦材料的处理
1.2.2 mRNA的分离
1.2.3 cDNA文库的构建
1.2.4 cDNA文库的筛选
2 结果与分析
2.1 探针的制备
2.2 cDNA文库的构建
2.3 cDNA文库的筛选
2.4 DREBs的序列分析
2.4.1 DREB2／DREB8的序列分析
2.4.2 DREB3／4／5的序列分析
2.4.3 DREB6／7的序列分析
2.4.4 DREB9／10的序列分析
2.4.5 DREB11的序列分析
2.5 ERFs(ethylene-responsive factors)的序列分析
2.5.1 ERF1的序列分析
2.5.2 ERF2的序列分析
3 讨论
第三章 目的基因全长cDNA序列的获得与基因结构的分析
1 材料与方法
1.1 材料
1.2 方法
1.2.1 小麦材料的处理
1.2.2 总RNA的提取
1.2.3 总RNA的纯化
1.2.4 采用5’-RACE法延伸基因的5’端
1.2.5 RT-PCR扩增cDNA全长
1.2.6 PCR产物的纯化
1.2.7 DH5α、JM109感受态的制备
1.2.8 PCR产物的连接与转化
2 结果与分析
2.1 DREB4基因全长序列的获得及基因结构分析
2.2 DREB8基因全长序列的获得
2.3 ERF1基因全长序列的获得及基因结构分析
3 讨论
第四章 DREB／ERFs基因的表达特性分析与染色体定位
1 材料与方法
1.1 材料
1.2 方法
1.2.1 小麦材料的处理
1.2.2 Northern blot
1.2.3 Southern blot
2 结果与分析
2.1 探针的扩增
2.2 基因表达特性分析
2.2.1 小麦总RNA的提取
2.2.2 DREB4基因的表达特性分析
2.2.3 ERF1基因的表达特性分析
2.2.4 ERF2基因的表达特性分析
2.3 基因的染色体定位
2.3.1 利用Southern blot进行基因染色体定位
2.3.2 利用PCR技术进行基因染色体定位
3 讨论
第五章 DREB／ERFs蛋白的结合特异性与激活功能分析
1 材料与方法
1.1 材料
1.2 方法
1.2.1 转录因子的体外结合特异性分析
1.2.1.1 融合表达载体的构建
1.2.1.2 融合蛋白的诱导表达及检测
1.2.1.3 融合蛋白的纯化回收
1.2.1.4 凝胶阻滞分析
1.2.2 转录因子的体内结合特异性和激活功能分析
1.2.2.1 YepGAP表达载体的构建
1.2.2.2 酵母感受态细胞的制备及转化
1.2.2.3 转录因子的体内结合特异性和激活功能分析
1.2.2.3.1 酵母报道子的构建
1.2.2.3.2 体内结合特异性和激活功能分析
2 结果与分析
2.1 转录因子的体外结合特异性分析
2.1.1 融合表达载体的构建
2.1.2 DREB／ERF融合蛋白的诱导表达
2.1.2.1 DREB融合蛋白的诱导表达
2.1.2.2 GST和ERF融合蛋白的诱导表达
2.1.3 DREB／ERF蛋白的凝胶阻滞分析
2.1.3.1 DREB蛋白的凝胶阻滞分析
2.1.3.2 ERF蛋白的凝胶阻滞分析
2.2 转录因子的体内结合特异性和激活功能分析
2.2.1 YepGAP表达载体的构建
2.2.2 DREB4／5的体内结合特异性和激活功能分析
3 讨论
第六章 DREB／ERFs基因的功能分析
1 材料与方法
1.1 材料
1.2 方法
1.2.1 双子叶植物转基因载体的构建
1.2.2 转基因拟南芥植株的获得
1.2.3 转基因烟草植株的获得
1.2.4 单子叶植物转基因载体的构建
1.2.5 转基因小麦植株的获得
2 结果与分析
2.1 双子叶植物转基因载体的构建
2.1.1 载体的构建
2.1.2 转化农杆菌
2.2 转基因拟南芥植株的获得及功能鉴定
2.2.1 拟南芥转化及筛选
2.2.2 转基因拟南芥植株的非生物胁迫分析
2.2.3 转基因拟南芥植株的抗病性分析
2.3 转基因烟草植株的获得及检测
2.3.1 转基因烟草植株的获得
2.3.2 转基因烟草植株的检测
2.4 转基因小麦植株的获得及功能鉴定
2.4.1 基因枪法转化小麦
2.4.2 T_0代转基因小麦再生植株的PCR检测
2.4.3 T_1代转基因植株的抗旱鉴定
3 讨论
第七章 结论
参考文献
附录1
附录2
致谢
作者简历
博士生期间发表或待发表的论文:
国际国内学术会议论文:
发布时间: 2005-09-05
参考文献
- [1].小麦抗逆相关的ERF转录因子基因及功能基因的克隆与表达特性研究[D]. 闵东红.西北农林科技大学2006
- [2].大豆MYB转录因子基因的克隆及其表达研究[D]. 杨文杰.四川农业大学2007
- [3].白羊草NAC转录因子基因的克隆、表达分析及遗传转化[D]. 方志红.山西农业大学2013
- [4].花生ERF转录因子基因克隆及其在非生物胁迫下的功能研究[D]. 张建成.山东农业大学2016
- [5].小麦体细胞杂种渐渗系山融3号抗逆相关转录因子基因家族及基因功能研究[D]. 朱馨蕾.山东大学2010
- [6].水稻DREB转录因子基因的克隆及相关研究[D]. 田秀红.中国农业大学2004