论文摘要
退行性精母细胞同系物1（DEGS1）最初是以表皮生长因子受体（EGFR）分子为“诱饵”通过酵母双杂交方法而筛选出来。我们首先通过免疫共沉淀（Co-IP）实验和pull down实验证明DEGS1能与EGFR相互作用。荧光共振能量转移（FRET）实验进一步证明显示DEGS1在细胞内与EGFR有直接的相互作用。由于DEGS1与EGFR在细胞内、外都能发生相互作用,我们将这两个分子共转染HEK293T细胞以验证DEGS1是否会影响EGFR的表达?共转染的实验结果显示,DEGS1的表达能抑制EGFR的蛋白表达而不影响其mRNA水平。这一点提示我们,DEGS1对EGFR的表达抑制不是在转录水平而是在翻译或翻译后的修饰方面。EGFR蛋白翻译后修饰的主要特点是蛋白表达后的泛素化过程。EGFR蛋白经过泛素化修饰后被运送至蛋白酶体进行降解。随后的泛素化实验证明,DEGS1的存在显著促进了EGFR蛋白的泛素化过程而与EGFR的磷酸化修饰无关。至此,我们了解到DEGS1能与EGFR相互作用并通过增加EGFR的泛素化程度而促进EGFR的降解,从而影响EGFR的蛋白水平。EGFR及其家族成员与肿瘤的关系密切,它们的表达影响着肿瘤病人的临床症状。EGFR在食管癌中有100%的高表达。而我们的实验证明,DEGS1能抑制EGFR的表达。于是我们想了解食管癌细胞中DEGS1与EGFR的表达模式及相互关系。我们检测了7株食管癌细胞系细胞,7株食管癌细胞系中EGFR的表达与DEGS1的表达呈反比例对应。即EGFR表达相对较高的细胞株其DEGS1表达相对较低,而EGFR表达相对较低的细胞株,其DEGS1表达相对则较高。为了更加深入地研究DEGS1与食管癌的关系,我们选择食管癌细胞系Eca109细胞进行进一步地研究。我们构建了DEGS1过表达的Eca109细胞稳定表达株,并运用慢病毒载体（Lentivirus）对本底的DEGS1水平进行RNA干涉。与对照细胞相比,DEGS1过表达Eca109细胞的体外生长能力、体外克隆形成能力、细胞迁移能力下降,DEGS1的表达也抑制了Eca109细胞的体内成瘤能力和体内转移的能力。相反,SiRNA下调DEGS1的表达后,Eca109细胞的体外生长能力、克隆形成能力、细胞迁移能力以及体内成瘤和转移能力反而增强。这些实验证明,DEGS1在食管癌细胞中的表达影响了食管癌细胞的体内外生长、增殖和迁移的能力。为了进一步阐明DEGS1抑制食管癌细胞生长、增殖及迁移的作用机制,我们首先检测了DEGS1对食管癌细胞的细胞周期的影响。我们将特异的DEGS1小分子RNA（SiRNA）克隆至慢病毒载体,293T中包装为成熟病毒后分别感染4株食管癌细胞Eca109、Caes17、KYSE-150和TE-12。用流式细胞仪对处与不同细胞周期的细胞进行记数。DEGS1 SiRNA下调DEGS1的表达水平后,细胞周期中处于不同时期的细胞数目有所改变。与对照细胞相比,SiRNA下调DEGS1水平后的细胞处于S期的数目明显增多,其所占比例达到70%左右,而对照细胞中处于s期的细胞只有50%左右。另一方面,SiRNA下调DEGS1水平后的细胞处于G0/G1期的比例为10%左右,比对照细胞的30%左右要少。另外,由于肿瘤的细胞的凋亡也会影响到它们的生长和增殖能力,我们也对DEGS1过表达的Eca109细胞及其对照细胞的细胞凋亡情况进行了检测。Annexin V/PI双染后,流式细胞仪检测发现,DEGS1过表达细胞中,凋亡细胞的比例增多。由此可见,DEGS1的表达加速了食管癌细胞系Eca109细胞的凋亡。更重要的是,接下来的实验证明,DEGS1的表达诱导了半胱氨酸蛋白酶（Caspase）家族中的Caspase-6分子的表达。将DEGS1分子转染至食管癌Eca109细胞,Western blotting检测几个Caspase家族的分子的蛋白水平后发现,在相继的几个时间点上,只有Caspase-6分子的蛋白水平升高,而Caspase-3、Caspase-7和Caspase-8的蛋白表达没有变化。RT-PCR检测DEGS1过表达Eca109细胞、DEGS1 SiRNA Eca109细胞及其对照细胞的mRNA水平发现,DEGS1过表达Eca109细胞中的Caspase-6 mRNA水平比对照细胞高。相反,DEGS1 SiRNA Eca109细胞中Caspase-6的mRNA水平则比对照细胞低。这些实验证明,DEGS1的表达能诱导凋亡相关的Caspase-6分子的mRNA和蛋白的表达。由于DEGS1过表达细胞中Caspase-6的蛋白和mRNA水平升高,我们用一个特别的报告基因系统来检测DEGS1对Caspase-6转录活性的影响。该系统将Caspase-6基因的启动子（promoter）克隆至含luciferase报告基因质粒pGL3-Basic的前端。在Capase-6启动子的前端分别克隆一段含CD1、CRE和NF-kappa B结合位点或CD1结合位点缺失或CRE、NF-kappa B结合位点点突变的前导序列。实验证明,DEGS1的表达促进了Caspase-6的转录活性而且这中促进作用是通过NF-kappa B途径来进行的。因为NF-kappa B结合位点的突变导致相对转录活性的下降。NF-κB进入细胞核内之前必须经过一个活化的阶段。这个活化过程包括IKK信号复合体的活化、NF-κB的抑制子IκB的磷酸化。接下来的实验显示,当NF-κB的活化被抑制时,DEGS1对Caspase-6转录的诱导也受到抑制。这说明NF-κB的活化是DEGS1促进Caspase-6转录,从而促进Caspase-6表达所必需的条件之一。综上所述,在本课题研究中我们首次报道:1、DEGS1分子通过促进EGFR分子泛素化水平的方式降低EGFR的蛋白表达。2、DEGS1分子的表达抑制食管癌细胞的生长、增殖和转移。3、DEGS1分子影响食管癌细胞的细胞周期和促进细胞凋亡,并通过NF-kappa B途径诱导细胞凋亡相关因子Caspase-6的表达。该研究结果为抑制肿瘤的发生、发展及其转移提供新的机制,同时也为肿瘤的临床治疗提供了新的理论依据。
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