论文摘要
目的:分析弥漫大B细胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma,DLBL）相关抗原特异T细胞克隆的TCR（T cell recepter,TCR）基因,扩增其全长基因序列,构建载有抗原特异TCRαβ双基因真核表达载体;转基因修饰正常人T细胞后使其强制性表达这种特异性TCR,证明其具有特异性识别和杀伤DLBL细胞的作用,为开展DLBL特异性靶向细胞免疫治疗提供基础资料。方法:通过TCR亚家族基因谱系分析方法（RT-PCR-基因扫描）分析3例DLBL患者外周血中TCR Vα和TCR Vβ亚家族T细胞的克隆性,对克隆性增殖的TCR Vα和TCR Vβ亚家族T细胞的TCR-CDR3区进行核苷酸序列分析,对于单克隆扩增的T细胞扩增其全长TCRα和β链基因序列,利用Primer Premier 5.0分析软件推算其相应的氨基酸序列。将CDR3区含有保守氨基酸模序的TCR和全长的TCR在自动化蛋白质模建服务器SWISS-MODEL上进行三维空间结构建模。将DLBL相关抗原特异TCRα和β链的全长基因序列分别定向克隆入真核表达载体,根据不同的转录匣结构,TCRα和β链基因①分别单独克隆入真核表达载体构建TCRα或TCRβ链单基因（P2）重组载体（α-IRES-EGFP、β-IRES-EGFP）;②通过一个IRES连接构建TCRαβ双基因真核表达载体（α-IRES-β、β-IRES-α）。通过转基因技术首先将其转导细胞株,检测抗原特异性TCRα和α基因在mRNA和蛋白质水平的表达情况。然后,通过Nucleofector核转染方法将其转染正常人T细胞,间接免疫荧光法、流式细胞术（flow cytometry,FCM）、real-time PCR和Western Blot检测抗原特异TCR基因修饰T细胞中外源TCRα和β链基因的表达情况,并进行体外细胞毒性实验以及检测活化和未活化的转基因修饰T细胞的TCRζ链基因的表达情况。应用基因表达谱芯片技术比较TCR转基因修饰T细胞与未修饰T细胞的基因表达谱的变化。结果:3例DLBL患者的外周血中均存在克隆性增殖的TCR Vα和TCR Vβ亚家族T细胞。本研究共分析了31个TCR基因的CDR3区（包括21个Vα和10个Vβ）,其中23个已在NCBI的GenBank中登记,TCR-CDR3区序列对比分析发现不同TCR Vα和TCR Vβ亚家族T细胞克隆的TCR-CDR3区含有保守氨基酸模序,其中来自P1患者Vα8S1-Jα34与Vα14S1-Jα34克隆的CDR3区不但氨基酸的一级结构高度保守,含有“RSxYNTDKLI”保守模序,而且其TCR蛋白质的空间结构也具有高度的同源性,SWISS-MODEL同源建模服务器分析显示两者具有同一个空间结构模型（PDB ID:2ak4D）;与TCRα链CDR3区的保守模序相比,TCRB链CDR3区的氨基酸更加保守,其中“GT”模序（4/10）和“RG”模序（3/10）高度保守,而且TCRB链CDR3区的“SxGTG”模序所属的Vβ9S1-Jβ2.1-Cβ2（P1）和Vβ15S1-Jβ2.1-Cβ2（P3）克隆的TCR也具有相同的结构模型（PDB ID:3dx9D）。同时,也扩增了6个全长的TCR基因序列（包括P1患者的TCR Vα23、P2的TCR Vα6和TCR Vβ13、P3的TCR Vα6、TCR Vα23和TCRβ13）,并申请了6项国家发明专利。经双酶切鉴定和核苷酸序列分析证实成功构建了多种不同的重组载体,包括2个TCRα或TCRβ单基因真核表达载体:TCR Vα6-IRES-EGFP和TCR Vβ13-IRES-EGFP（P2）和4个TCRαβ双基因真核表达载体:TCR Vα6-IRES-TCR Vβ13和TCRVβ13-IRES-TCR Vα6（P2）、TCR Vβ13-IRES-TCR Vα6和TCR Vβ13-IRES-TCR Vα23（P3）。抗原特异TCRαβ真核表达载体转导细胞株后,外源TCRα和β基因在mRNA和蛋白水平都能稳定表达,但3种转录匣并没有显示出明显的差异;将4种抗原特异TCRαβ双基因真核表达载体分别转导正常人T细胞获得DLBL特异性细胞毒T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte,CTL）,经激光共聚焦显微镜（laser confocal microscopy,LSM）和FCM检测转染效率约20～50%,在mRNA和蛋白水平也分别能检测到外源TCRα和β链基因的表达。抗原特异TCR基因修饰T细胞对DLBL细胞株显示出特异的细胞毒活性,并且β-IRES-α转录匣的TCR Vβ13-IRES-TCR Vα6（P2和P3）的双基因真核表达载体的转染效率以及转导细胞的杀伤活性均处于稍强的优势,优于α-IRES-β转录匣（P2）和TCR Vβ13-IRES-TCR Vα23重组载体（P3）。经活化的转基因修饰T细胞的TCRζ（CD3ζ）链基因的表达水平高于未活化或未经TCR基因修饰者;与未转基因的正常T细胞相比,未活化的TCR转基因修饰T细胞的TCRζ链基因的表达水平没有发生明显的变化。通过人类全基因组表达谱芯片筛选了抗原特异TCR基因转导T细胞后的差异表达基因,并对其进行了生物学功能的分析。GO分析表明差异表达基因主要与趋化性、免疫反应、炎症反应、细胞钙离子稳态、G蛋白耦联受体蛋白信号传导、细胞表面受体连锁的信号传导等生物学过程和趋化因子活性、G蛋白耦联受体结合、MHC-肽结合、信号转导活性等分子功能密切相关;Pathway分析发现这些差异表达的基因主要参与CD4+TCR信号传导中的RAS通路、CD8+na（?）ve T细胞的TCR信号转导、钙调神经磷酸酶（calcineurin,CaN）/NFAT信号通路、磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K）信号通路、IL-23介导的信号传导通路和p38 MAPK信号通路等（P＜0.05）。并且这些生物学功能所涉及的基因绝大部分是表达上调的基因。结论:DLBL患者外周血中TCR Vα和Vβ亚家族T细胞克隆的TCR-CDR3区含有保守氨基酸模序,并且其空间结构也具有高度同源性,推测这些T细胞克隆是由同一个肿瘤相关抗原肽表位刺激而产生。成功构建抗原特异TCRαβ双基因真核表达载体,并转基因修饰正常人T细胞获得DLBL特异性CTL,证实其对DLBL细胞具有特异性识别和杀伤作用,并且TCRβ-IRES-TCRα转录匣转导的T细胞显示出较强的杀伤效力。抗原特异TCR基因修饰后T细胞的多个信号通路相关基因表达发生变化。研究结果为探讨DLBL特异或相关抗原为基础的特异性TCR转基因修饰T细胞用于DLBL患者的过继性免疫治疗提供基础研究资料。
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相关论文文献
- [1].抗原特异TCR Vα6-pIRES2-EGFP和TCRV β13-pIRES2-EGFP真核表达载体的构建及共转染研究[J]. 免疫学杂志 2009(01)
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