体外构建U6/H1双启动子SECs及其对HepG2细胞端粒酶活性抑制的研究

论文摘要

目的:利用重叠延伸拼接（splicing by overlap extension,SOE）PCR技术构建相对排列的U6/H1双启动子siRNA表达框架（siRNAexpression cassettes,SECs）,并针对人端粒酶hTERT基因外显子不同片段构建三条U6/H1双启动子SECs,通过对肝癌细胞株HepG2细胞端粒酶hTERT基因表达进行RNA干扰来考察U6/H1启动子SECs的干扰作用,从而为siRNA的制备及肿瘤基因治疗探索新的途径。方法:分别以pSUPER质粒和pRNAT-U6.1/Neo质粒为模板,根据端粒酶hTERT基因外显子核酸序列（genebank（NM198253））1778-1796,2650-2668,1943-1961三个位点分别设计特异引物,利用重叠延伸拼接PCR方法构建两端为相对排列的U6和H1启动子、中间部分为与端粒酶hTERT特定序列同源的可双向转录的SECs。将该产物纯化后用磷酸钙共沉淀法转染HepG2细胞,用适时荧光定量PCR法检测细胞hTERT mRNA的表达量,用TRAP-PCR银染法定性检测端粒酶活性,来观察构建的U6、H1双启动子SECs的RNA干扰作用。结果:2.5%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物显示:第一阶段PCR反应产物单U6启动子正义SECs片段、单H1启动子反义SECs片段长度分别为335bp和245bp,第二阶段PCR片段长度分别为反应产物U6、H1双启动子SECs片段长度为561bp。将四段双启动子SECs产物纯化后分别转染HepG2细胞,检测端粒酶hTERT mRNA及活性,针对hTERT（genebank NM198253）1778-1796,2650-2668,1943—1961的U6、H1双启动子SECs对后hTERT mRNA量显著下降,端粒酶活性明显降低。hTERTmRNA表达的抑制率分别为37.0%、50.1%和37.0%。处理组的相对端粒酶活性抑制率分别为55.0%、76.5%和47.6%。而阴性对照SECs无RNA干扰作用,端粒酶表达及活性检测未见抑制。结论:利用融合PCR技术成功构建针对hTERT的U6、H1双启动子SECs,并对端粒酶的表达产生了有效的RNA干扰作用,该siRNA制备方法快速,成本低,不引入外源DNA片断,可为快速广泛筛选干扰位点和建立RNAi文库开拓新的思路。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 中英文词汇简表
• 第一章 前言
• 1.1 RNA干扰
• 1.2 端粒、端粒酶和hTERT
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 细胞
• 2.1.2 试剂
• 2.1.2.1 U6/H1双启动子SECs合成及转染试剂
• 2.1.2.2 细胞培养及转染所需试剂
• 2.1.2.3 适时荧光定量hTERT mRNA表达检测所需试剂
• 2.1.2.4 端粒酶活性检测试剂
• 2.1.3 仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 U6/H1双启动子SECs的构建
• 2.2.2 细胞培养、转染
• 2.2.3 hTERT mRNA表达定量检测
• 2.2.4 端粒酶活性的检测
• 2.2.5 统计分析
• 第三章 结果
• 3.1 U6/H1双启动子SECs的构建
• 3.1.1 琼脂糖凝胶电泳结果
• 3.1.2 第一步和第三步PCR反应产物DNA回收纯化后经紫外分光光度法定量分析
• 3.1.3 U6/H1双启动子SECs测序结果
• 3.2 适时荧光定量PCR法检测hTERT mRNA表达量
• 3.2.1 总RNA提取和鉴定
• 3.2.2 管家基因及hTERT mRNA扩增曲线及熔解曲线
• 3.2.3 数据及分析
• 3.3 双启动子SECs对HepG2细胞端粒酶活性的影响
• 第四章 讨论
• 4.1 RNA干扰及U6/H1双启动子SECs的体外构建
• 4.2 SECs体外对HepG2细胞hTERT的特异抑制作用
• 4.3 问题与展望
• 第五章 结论
• 第六章 参考文献
• 第七章 综述
• 致谢
• 攻读学位期间研究成果