导读:本文包含了活性成分发现论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:佛甲草,化学成分,非小细胞肺癌,CCK-8
活性成分发现论文文献综述
杜丽洁[1]（2019）在《佛甲草抗肺癌活性成分的发现及活性研究》一文中研究指出目的:佛甲草(Sedum lineare Thunb)是为景天科(Crassulaceae)佛甲草属多年生草本植物,是一种常用的民族民间用药。本文旨在对佛甲草全草进行系统的化学成分分离与鉴定,并对其进行抗肺癌活性的研究。方法:1、用液-液萃取、硅胶柱色谱、C18反相柱色谱、SephadexTMLH-20凝胶柱色谱、快速制备色谱及半制备HPLC等方法对佛甲草总提物进行系统的分离、纯化,用UV、ESI-MS、NMR等数据对所分离的单体化合物进行结构鉴定。2、用CCK-8法检测佛甲草总提物及各萃取部位对非小细胞肺癌A549细胞的增殖抑制作用,计算半数抑制浓度IC50值,筛选出抗肺癌活性较好的萃取部位进行单体化合物的分离。3、用CCK-8法检测各单体化合物对非小细胞肺癌A549细胞的增殖抑制活性,计算半数抑制浓度IC50值,比较各单体化合物与阳性对照药人参皂苷Rg3对A549细胞增殖的抑制作用。4、通过划痕实验检测各单体化合物对A549细胞的转移影响。比较各单体化合物与空白对照组对A549细胞转移的影响。结果:1、从佛甲草80%乙醇提取物中分离纯化得到8个单体化合物,并根据其理化常数及波普解析对其结构进行鉴定。鉴定出其分别是化合物1芹菜素(Apigenin)、化合物2 3-0-甲基槲皮素(3-O-Methylquercetin)、化合物3木犀草素-4'-O-β-D-(6"-E-咖啡酰)-吡喃葡萄糖苷(Luteolin 4'-O-β-D-(6"-E-caffeoyl)-glucopyranoside)、化合物4槲皮素(Quercetin)、化合物5 木犀草素(Luteolin)、化合物6木犀草素-4'-葡萄糖苷(Luteolin-4'-glucoside)、化合物7绣线菊苷(Spiraea)、化合物8腺苷(Adenosine),其中化合物1、2、3、6、7、8是从该植物中首次分离得到的。2、佛甲草总提物对A549细胞具有较强的抑制作用,乙酸乙酯部位、正丁醇部位能够很强的抑制A549细胞增殖的活性,半数抑制率分别是78.23μg/mL、89.45μg/mL,与对照组相比,具有非常显着地差异。而石油醚部位、二氯甲烷部位、水部位表现出来一定的抑制活性,但半数抑制浓度已经超过500μg/mL,抑制活性相对较弱。3、化合物6对A549细胞有一定的抑制作用,且与给药剂量成相关性,随着药物浓度的增加,其抑制率逐渐增大,半数抑制浓度为70.47 μmol/L。化合物4在浓度高于31.25 μmol/L时,抑制率基本不变。化合物5、化合物7、化合物8当浓度达到250 μmol/L时,其抑制率没达到50%,且随着药物浓度的增加,这四种化合物的抑制率变化不大,与阳性对照Rg3相比,抑制作用相对较弱。4、划痕实验表明,六种单体化合物对A549细胞的转移具有一定的抑制作用。其中化合物6的划痕面积改变率最低为3.16%,说明化合物6对A549细胞的转移具有较强的抑制作用。与空白对照组相比,化合物4、化合物7的划痕面积改变率相对较小,化合物8的划痕面积改变率较大,表明化合物4、化合物7能较强的抑制A549细胞的迁移,化合物8的作用则相对较弱。化合物4、化合物7能够较强的抑制A549细胞的转移,而化合物5、化合物8的抑制作用较弱。结论:从佛甲草提取物中分离纯化得到8个单体化合物,鉴定出其分别是化合物1芹菜素(Apigenin)、化合物2 3-O-甲基槲皮素(3-O-Methylquercetin)、化合物3木犀草素-4'-O-β-D-(6"-E-咖啡酰)-吡喃葡萄糖苷(Luteolin 4'-O-β-D-(6"-E-caffeoyl)-glucopyranoside)、化合物4槲皮素(Quercetin)、化合物5木犀草素(Luteolin)、化合物6木犀草素-4'-葡萄糖苷(Luteolin-4'-glucoside)、化合物7绣线菊苷(Spiraea)、化合物8腺苷(Adenosine),其中化合物1、2、3、6、7、8是从该植物中首次分离得到的。佛甲草各萃取部位中,乙酸乙酯部位和正丁醇部位对A549细胞的抑制作用较强,推测佛甲草抗肺癌活性成分可能集中在这两个萃取部位。化合物6对A549细胞有一定的抑制活性,其抑制率与给药浓度呈正相关,而化物4、化合物5、化合物7、化合物8的抗肺癌活性则相对较弱。本文初步研究了佛甲草各部位及其化学成分对A549细胞增殖及转移作用的影响,为进一步研究佛甲草治疗肺癌及其他肿瘤提供一定实验依据。(本文来源于《中央民族大学》期刊2019-05-20）
李妍茹[2]（2019）在《天然来源抗慢性阻塞性肺疾病活性成分发现及作用机制研究》一文中研究指出大气污染物、环境毒物、氧化剂侵袭人体组织器官,引起氧化应激与炎症反应,进一步诱发慢性阻塞性肺病(COPD)等疾病,抑制氧化应激和炎症反应可有效干预COPD 病理进程。Nrf2(Nuclear factor-erythroid 2-related factor 2)通路是调控人体氧化还原平衡的关键通路,Nrf2通过编码Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶抑制氧化应激,调节机体氧化还原平衡;NF-κB(Nuclear factor κB)通路是调控人体炎症反应的关键通路,抑制NF-κκB能有效抑制机体炎症反应。因此,激活Nrf2通路和抑制NF-κκB通路,是抑制氧化应激与炎症反应的有效策略,是研发治疗COPD药物的重要途径。天然产物对人类药物发展史做出了重要贡献,从天然产物中寻找先导化合物和药物,是创新药物研发的重要途径。本文围绕“天然来源抗COPD活性成分发现及作用机制”方向,针对抑制氧化应激和炎症反应策略,完成了以下叁部分研究工作:第一部分:异黄酮7-MBA抑制氧化应激作用机制黄酮是一类重要的天然来源抗氧化剂,因其具有直接的自由基清除作用广受关注,但缺少黄酮通过上调抗氧化系统抑制氧化应激的系统性研究。课题组通过建立结构新颖多样的天然黄酮化合物库,采用NAD(P)H:醌还原酶(QR)诱导活性实验,筛选获得了具备强抗氧化应激活性化学组分——异黄酮7-MBA,并对此化合物开展了作用机制研究。发现:C①7-MBA能够上调NrfS、Ⅱ相脱毒酶:醌氧化还原酶1(NQO1)和抗氧化酶:γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)蛋白水平;②7-MBA通过作用于蛋白激酶促进Nrf2蛋白磷酸化修饰激活Nrf2通路;③7-MBA能够抑制Nrf2蛋白泛素化降解,延长Nrf2蛋白半衰期,增强Nrf2蛋白稳定性。申请人建立了砷诱导人肺上皮Beas-2B细胞氧化损伤模型,探究7-MBA对细胞氧化损伤的保护作用,发现:7-MBA能够上调细胞内源性抗氧化剂谷胱甘肽(GSH)水平,下调细胞内源性活性氧(ROS)表达,抑制砷诱导的Beas-2B细胞损伤凋亡,结果呈Nrf2依赖性。本研究工作确证了 7-MBA为新型异黄酮型Nrf2激动剂,探讨了其对COPD的预防治疗潜力。第二部分:芳樟抑制炎症反应活性成分发现及作用机制芳樟是我国传统药用植物,提取物具有抗炎活性,但目前并未见芳樟抗炎化学成分及作用机制研究报道。因此,课题组采用细菌脂多糖(LPS)诱导的小鼠RAW264.7巨噬细胞细胞炎症模型,开展了芳樟抗炎化学成分活性筛选和作用机制探究。首先,课题组通过对前期获取的25种芳樟化学成分进行抗炎活性筛选,确证了 8种天然化合物为芳樟植物抗炎活性分子,分别为:苯丙醇类、木脂素类、黄酮类、香豆素类和萜类化合物。其中,木脂素SMO和萜类化合物NLD首次被发现具有抗炎活性。因此,课题组对其开展了抗炎作用机制探究。发现:SMO和NLD能通过抑制NF-κB通路,下调肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)和前列腺素E2(PGE2)等炎症因子的表达,抑制LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、环氧合酶2(COX-2)和基质金属蛋白酶9(MMP-9)等炎症蛋白mRNA和蛋白水平的增加,缓解炎症反应,表现出防治炎症诱发相关疾病的活性潜力。本研究工作确定了苯丙醇类、木脂素类、黄酮类、香豆素类和萜类化合物为芳樟治疗炎症疾病的物质基础,发现了木脂素SMO和倍半萜NLD两个新型抗炎活性分子,阐明了抑制炎症反应的作用机制,确证了二者通过抑制炎症反应防治COPD的活性潜力。通过前面两部分研究工作,课题组分别从抗氧化应激和抗炎症反应两个角度,发现并探究了新型活性成分作用机制及干预COPD潜力。接下来,将进一步从氧化应激和炎症反应双重抑制角度寻找活性更强的先导化合物,为研发防治COPD药物奠定基础。第叁部分:滇南木姜子中氧化应激和炎症反应双重抑制活性成分发现及作用机制课题组前期研究发现,樟科木姜子属植物滇南木姜子提取物具有较强的氧化应激和炎症反应双重抑制活性,但目前尚无滇南木姜子化学成分和生物活性相关性研究报道。课题组通过QR和NO生成抑制实验,评价了从滇南木姜子中分离获得的22种化学成分的抗氧化抗炎活性,发现了 3-甲氧基-5-戊基苯酚(MPP)、5-羟乙基水杨酸、山奈酚和槲皮素,四种具有氧化应激和炎症反应双重抑制活性的化学组分。通过进一步开展MPP抑制氧化应激和炎症反应作用机制研究,发现:①MPP能够通过增加Nrf2蛋白稳定性、抑制Nrf2蛋白降解,上调Nrf2及其调控的Ⅱ相脱毒酶NQO1和抗氧化酶GCLM蛋白水平;②MPP能够抑制LPS诱导的NF-κB信号通路,干扰炎症基因表达。采用砷诱导的人肺上皮Beas-2B细胞损伤模型,评价了 MPP对抗氧化损伤作用潜力,发现MPP能够增加细胞内源性抗氧化剂GSH水平,抑制砷诱导Beas-2B细胞损伤和凋亡;采用LPS诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7炎症模型,评价了 MPP的抗炎作用,发现MPP能够通过上调NF-κB抑制蛋白IκBα水平抑制NF-κB亚基p65活化,降低炎症介质TNF-α,IL-1β和炎症相关蛋白iNOS,COX-2水平,抑制细胞炎性反应。本研究确定了 MPP、5-羟乙基水杨酸、山奈酚和槲皮素4种活性成分为滇南木姜子抑制氧化应激和炎症反应的物质基础。其中,MPP通过靶向Nrf2调控的抗氧化系统和NF-κB调控的炎症系统发挥氧化应激和炎症反应双重抑制作用,并能够抑制砷诱导的细胞损伤,具有成为防治COPD先导化合物的作用潜力。综上所述,本课题从抑制氧化应激和炎症反应角度,首次发现了四种具有干预COPD病理进程活性潜力的天然化合物,包括:异黄酮7-MBA、木脂素SMO、倍半萜NLD和酚类MPP,此外,课题组进一步确证了上述四种化合物抑制氧化应激和炎症反应的作用机制,为COPD干预药物研发奠定了研究基础。(本文来源于《山东大学》期刊2019-04-03）
魏娇娇[3]（2018）在《抗血栓活性成分的发现及吡唑类化合物抗肿瘤研究》一文中研究指出天然产物是指动物、植物提取物或昆虫、海洋生物和微生物体内的组成成分或其代谢产物以及人和动物体内许多内源性的成分。天然产物的结构类型多种多样,包括蛋白质、多糖、黄酮、酚类、生物碱类、萜类、甾体等等。天然产物的生物活性广泛,近年来,从天然产物中寻找活性成分及对其进行结构修饰以期获得先导化合物或者药物,成为药物化学研究的热点。本论文包括两个部分,第一部分是药用植物中抗血栓活性成分的发现,第二部分是新型抗肿瘤吡唑类化合物的设计合成及构效关系的研究。论文的第一部分对叁种药用植物垂穗石松(Palhinhaea cernua(L.)Franco et Vasc.)、榅桲(Cydonia oblonga mill.)和砂仁(Amomum villosum Lour.)进行了系统的化学成分的研究,运用了多种色谱柱层析分离手段包括硅胶、MCI gel CHP-20P、Chromatorex C_(18)、TSK gel Toyopearl HW-40F、Sephadex LH-20以及半制备高效液相色谱等对其提取物进行分离纯化,并且通过波谱学技术、X-射线单晶衍射等方法鉴定了74个化合物,其中新化合物10个。从垂穗石松(Palhinhaea cernua(L.)Franco et Vasc.)全草的乙醇提取物中分离鉴定了18个化合物,其中化合物1-5为新化合物,结构类型均为石杉型叁萜,并对该类化合物的生源途径进行了分析推测;从榅桲(Cydonia oblonga mill.)枝叶的乙醇提取物中分离鉴定了25个化合物,包括叁萜类、木脂素类、黄酮类化合物及二苯并呋喃类化合物,其中新化合物有4个,3个为二苯并呋喃类(40-42),1个为木脂素(43);从砂仁(Amomum villosum Lour.)干燥果实的丙酮提取物中分离鉴定了31个化合物,结构类型包括萜类、生物碱类、酚类、甾体类化合物,其中新化合物1个(44)。对所分离得到的部分化合物进行抑制血小板聚集活性研究,其中已知化合物36和新化合物42表现出较强的抑制血小板聚集的活性,在终浓度为10μM时,对ADP诱导的大鼠血小板聚集抑制率均大于40%。论文的第二部分是新型抗肿瘤吡唑类化合物的设计合成及其构效关系的研究。该部分设计合成了叁种结构类型的化合物共69个,包括1,5-二芳基吡唑类化合物(W1-W35)、邻位吡唑酮类化合物(W36-W41)及间位吡唑酮类化合物(W42-W69),并且发现了一种快速有效构建间位吡唑酮类化合物的新方法。采用CCK-8法研究化合物在细胞株A549(人肺癌细胞)、SMMC-7721(人肝癌细胞)、HL-60(人白血病细胞)体外抗肿瘤活性,并进行了构效关系的总结。体外活性测试结果显示,化合物W24,W29具有较强的抑制肿瘤细胞增殖的活性(对人肝癌细胞SMMC的IC_(50)值分别为0.7μM,0.03μM)。在此基础上,对体外活性较好的化合物W24,W29进行小鼠体内抗肿瘤活性评价。此项研究为进一步开发抗肿瘤药物提供基础以及研究的方向。(本文来源于《中国科学院大学(中国科学院上海药物研究所)》期刊2018-06-01）
刘灿,生吉萍,David,Yue,Wei,Lee,李小可[4]（2017）在《双孢菇内生枯草芽孢杆菌AB154中抑制人结肠癌Caco-2活性成分的发现及机理研究》一文中研究指出在研究双孢菇的抗肿瘤活性成分时,发现其内生的一个枯草芽孢杆菌AB154的代谢产物,该产物具有较强的抑制人结肠癌Caco-2细胞活性。借助体外多种细胞毒活性跟踪测试,利用硫酸铵沉淀法和DEAESephadex阴离子交换柱层析,从枯草芽孢杆菌AB154发酵液中分离得到抑制人结肠癌Caco-2细胞的活性组分,其IC50为109.94μg/m L,而对人正常支气管上皮细胞(NHBE)的抑制作用较弱。经高效液相色谱(HPLC)制备,结合MALDI-TOF MS、ESI-MS/MS分析和查阅文献,从活性组分中分离鉴定了2个亚组分表面活性肽(surfactin)和丰原素(fengycin)B1类脂肽,其抑制人结肠癌Caco-2细胞的IC_(50)依次为80.7μg/m L和312.5μg/m L。此研究首次发现fengycin B1类脂肽具有抑制人结肠癌Caco-2细胞的活性,机理研究发现fengycin B1在12 h时将细胞周期阻滞在G_0/G_1期,在24 h时阻滞在S期,同时能够损伤肿瘤细胞的细胞核。(本文来源于《中国食品学报》期刊2017年12期）
黄海华[5]（2017）在《虫草抗癌活性有了证据》一文中研究指出虫草入药在我国具悠久历史。67年前，虫草素的结构第一次被发现，这一成分后来被发现具有抗菌抗癌等生物活性，但其合成机理一直不为人知。昨天，《细胞》子刊在线发表中科院上海植物生理生态研究所王成树团队的最新研究成果。他们完整解析了虫草素生物合成的分子机理，首次(本文来源于《解放日报》期刊2017-10-20）
刘树民,张帅男,张宁,卢芳[6]（2017）在《刺五加潜在靶点网络辅助活性成分效应的发现》一文中研究指出目的:探讨刺五加醇提取物对机体的潜在保护作用和物质基础。方法:体外实验:首先采用UPLC-QTOF-MS对刺五加醇提取物的成分进行定性分析。其次,通过TCMSP数据库对每种成分进行成药性分析。再结合Pubmed数据库挖掘每种成分的生物学效应。最后结合前期代谢组学研究成果,构建刺五加的潜在作用靶点-药效物质网络。体内实验:SD雄性大鼠随机分为空白组和刺五加组(31.6 mg/kg),每组10只,每日灌胃一次,连续20天。测定大鼠肾脏组织一氧化氮(NO)含量。结果:发现了5种成药性良好的成分,分别为刺五加苷B、刺五加苷E、红景天苷、异类叶升麻苷和橄榄苦苷。与空白组相比(5.7±0.3)μmol/gprot,刺五加组可显着升高NO(12.7±1.3μmol/gprot)含量。通过潜在作用靶点-药效物质网络,发现橄榄苦苷可通过上调内源性代谢物四氢喋啶来增加NO在肾脏中的含量。结论:刺五加具有抗氧化和降低肾血管血压的作用的物质基础是橄榄苦苷,其机制可能与其上调内源性代谢物四氢喋啶的含量,激活瓜氨酸的表达,来增加NO在肾脏中的含量从而产生对肾脏血管的潜在保护作用有关。(本文来源于《中药药理与临床》期刊2017年05期）
孔德云,吴彤[7]（2017）在《植物资源活性成分研究及新药的发现》一文中研究指出中国医药工业研究总院上海医药工业研究院中药创新中心一直致力于中药及天然药物的研究与开发,具体包括中药、天然药物活性成分、先导化合物的发现和结构改造;传统中药材、提取物和中药制剂质量控制方法和标准建立;中药、天然药物的创新药研发,中药天然药物新资源、新用途和新产品开发等3个方面。本文对中心近10年的主要工作进行回顾。(本文来源于《中国医药工业杂志》期刊2017年03期）
王海强[8]（2017）在《基于活性指数和液质联用技术的桂枝加芍药汤抗炎活性成分快速发现研究》一文中研究指出中药方剂活性成分发现是中药现代化研究的重要内容。目前,中药活性成分发现的主要方法有系统分离法、活性导向法、生物色谱法等,前两种方法研究周期长、耗时耗力、命中率低,生物色谱法可以从混合物中快速发现含量较高的潜在活性成分,但可能会忽略某些微量活性成分。为克服以上研究方法的不足之处,本论文通过采用活性指数方法评价中药及其组分中各成分对其活性的贡献,从而预测其中潜在活性成分,并将该研究思路用于仲景方桂枝加芍药汤中抗炎活性成分的快速发现。桂枝加芍药汤出自于《伤寒论》,由桂枝、白芍、生姜、大枣和甘草组成,具有温脾和中,缓急止痛的功效。临床上主要用于治疗腹满引起的胀痛,还可以治疗顽固性菌痢,十二指肠球部溃疡,结核性腹膜炎等疾病。目前该方的药效物质基础尚不清楚。本论文以桂枝加芍药汤为研究对象,以方剂中抗炎活性成分的快速发现为研究目标,具体研究如下：采用液相色谱-四级杆飞行时间质谱(LC-Q-TOF-MS)和液相色谱-离子阱质谱(LC-IT-MS)联用方法对桂枝加芍药汤总提物中化学成分进行了分析。共检测到72个化合物,鉴定和推测了其中54个化合物结构,主要类型包括单萜苷类、叁萜皂苷类、黄酮及其苷类和有机酸及其苷类。采用大孔树脂和制备液相色谱方法将桂枝加芍药汤总提物分段制备成64个组分。利用LC-IT-MS对各个组分的化学成分进行表征,一共检测到903个化合物。采用细菌脂多糖(LPS)诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7炎症模型,对桂枝加芍汤汤组分的抗炎活性进行评价。最后整合组分的化学信息和药理信息,计算各成分的活性指数,发现61个化合物有较高的活性指数值,推测这些化合物可能是潜在的抗炎活性成分。为了验证预测结果,对其中8个化合物进行了LC-MS导向的半制备液相色谱分离制备,采用NMR谱鉴定其结构,利用LPS诱导小鼠巨噬细胞RAW 264.7的炎症模型进行抗炎活性验证。研究发现,8个化合物均有良好的抗炎活性,其中6个化合物的抗炎活性明显强于阳性药吲哚美辛。此外,3个化合物的抗炎活性为首次报道。本研究结果表明活性指数方法能快速有效地发现中药方剂中的抗炎活性成分。(本文来源于《浙江大学》期刊2017-01-01）
宋慧鹏,杨华,高雯,陈君,李萍[9]（2016）在《中药活性成分发现关键技术研究进展》一文中研究指出中药是当今新药研发的重要来源之一。现代科学技术的迅猛发展为中药研究带来了新的机遇,同时也促进了中药理论的不断创新。建立既符合中药特点又适应现代药物研发的理论和技术是中药药效物质研究迫切需要解决的问题。本文结合笔者课题组近5年的研究实例,介绍了中药活性成分发现的关键技术,包括化合物库制备-活性评价-结构鉴定一体化技术、生物垂钓和化学垂钓技术、基于配体和受体的虚拟筛选技术、中药谱效关联发现技术、等效成分群发现技术等,以期为中药药效物质研究提供一定的参考,进而加快中药现代化进程。(本文来源于《世界科学技术-中医药现代化》期刊2016年07期）
高爽[10]（2016）在《以泛素结合酶UbcH5c为靶标的倍半萜内酯类活性成分的发现及其抗炎作用研究》一文中研究指出泛素结合酶UbcH5c介导的信号蛋白泛素化在TNF-α诱导的NF-κB信号通路活化中起关键性作用,因而是潜在的抗炎靶点。课题组在前期研究中发现一种从菊科植物旋覆花中分离得到的天然倍半萜内酯化合物IJ-5通过选择性地抑制UbcH5c,阻断了 TNF-α,刺激的NF-κB信号通路的活化及促炎细胞因子的表达,进而发挥体内抗炎作用。进一步分子机制研究发现IJ-5通过其活性基团α-亚甲基-γ-内酯环与UbcH5c的酶活性结构域的85位半胱氨酸残基(Cys85)发生共价结合从而抑制了UbcH5c的活性,因此,IJ-5作为靶点机制明确的抗炎先导化合物值得进一步研究。但IJ-5在旋覆花中丰度极低,分离纯化困难,且至今尚未实现全合成,限制了对其进一步深入的研究开发。基于此,本研究以UbcH5c为靶标,对天然和半合成的倍半萜内酯进行筛选并进行活性化合物的抗炎作用研究,以期发现丰度高或易于合成的对UbcH5c具有明确抑制活性和抗炎活性的化合物,以解决先导化合物IJ-5难以分离及合成的问题,为研发抗炎新药提供成药性更高的候选化合物。研究方法:1、采用体外泛素结合酶活性测定系统对候选化合物的UbcH5c抑制作用进行筛选;候选化合物包括以来源广泛的α-山道年为起始原料经过结构修饰得到的多个系列的含有α-亚甲基-γ内酯环的半合成倍半萜内酯化合物,以及从植物中分离得到的天然倍半萜内酯化合物,重点为高丰度的天然倍半萜内酯,包括土木香内酯、异土木香内酯以及以两者为主要成分的土木香总内酯;2、采用NF-κB荧光素酶报告基因和Western blot法检测活性化合物对TNF-α诱导的细胞内NF-κB通路活化的影响;3、采用Biacore技术测定活性化合物与UbcH5c的相互作用;4、采用计算机分子对接模拟目标化合物与UbcH5c的结合方式;5、采用免疫共沉淀测定目标化合物对NEMO线性泛素化的影响;6、采用实时定量PCR(qPCR)检测目标化合物对TNF-α刺激的炎症相关细胞内促炎因子表达的影响;7、采用DNCB诱导的小鼠湿疹模型评价活性化合物的体内抗炎作用。研究结果:1、从本课题组的天然化合物库中挑选了近20种不同结构类型的天然倍半萜内酯类化合物,比较了它们对UbcH5c的抑制活性,发现除了 IJ-5所属的桉烷型倍半萜内酯化合物外,其他结构类型如愈创木烷型、吉玛烷型的倍半萜类酯类化合物也具有UbcH5c活性,据此确定筛选范围可以不局限于桉烷型,而是可以扩展到其他结构类型的倍半萜内酯。2、以α-山道年(α-santonin)为起始原料通过氧化还原、重排等方式合成了十余种不同结构类型的倍半萜内酯化合物,初步筛选发现其中3个山道年衍生物(分别命名为化合物6,10和20)在10 μM浓度时具有一定的UbcH5c抑制活性,但作用较弱;进一步以化合物6,10和20为前体进行结构修饰得到3个系列、共计73个结构衍生物,从中筛选得到了 14个能够在5 μM浓度下对UbcH5c具有显着抑制作用的化合物,分别为:1a、1b、1e、2f、4c、5a、5g、5f、6i、6d、6g、8a、8b、9a。3、采用NF-κB荧光素酶报告基因和Western blot法对上述活性化合物进行进一步筛选,从上述14种活性化合物中发现1a、1b、5g、6d、8a、8b等6个化合物能够在细胞水平抑制TNF-α诱导的NF-κB信号通路的活化。4、化合物1a、1b、5g、6d、8a、8b在2.5-10 μM范围内能够剂量依赖的抑制UbcH5c活性,而且除5g外,其余化合物对另一种泛素结合酶Ubc13均无抑制作用,这一结果进一步验证了活性化合物对UbcH5c的抑制作用,同时还初步提示活性化合物对UbcH5c的抑制作用具有一定的选择性。5、Biacore分析结果表明化合物6d与UbcH5c的亲和力最强,KD值为0.873μM,因此以6d作为目标化合物进行后续研究。6、计算机对接分析发现6d与UbcH5c的活性口袋具有很好的互补性。除了与Cys85形成共价键外,6d分子中的羰基和氧醚还可以分别和UbcH5c中Cys85附近的Arg90和Gln92产生氢键,限制了 6d只能与Cys85结合而不能作用于UbcH5c中其它的Cys。7、免疫共沉淀结果显示6d在2.5-10 μM范围内可以剂量依赖的抑制TNF-α诱导的细胞内信号分子NEMO的线性泛素化,提示6d可以在细胞内通过拮抗UbcH5c的作用进而抑制NEMO发生线性泛素化来抑制NF-κB通路的活化。8、6d能够在1-5 μM范围内剂量依赖地抑制TNF-α刺激的人原代滑膜细胞表达关节炎相关细胞因子:IL-1、MCP-1、MMP-3,提示该化合物可能具有抗关节炎活性。9、对植物中高丰度的天然倍半萜内酯类化合物进行UbcH5c抑制活性的初步筛选,发现在无细胞的体外E2酶活性检测体系中,土木香内酯对UbcH5c的酶活性有显着的抑制作用,但其同分异构体异土木香内酯的作用则极其微弱;含有土木香内酯和异土木香内酯的土木香总内酯对UbcH5c也具有显着的抑制活性;而且土木香内酯及异土木香内酯对Ubc13均无抑制作用。10、以Biacore技术分析土木香内酯和异土木香内酯与UbcH5c的直接相互作用,发现土木香内酯与UbcH5c的亲和力相对较强,结合解离常数KD值为32.7μM;而异土木香内酯与UbcH5c的结合极弱,测得的KD值仅为159.7μM。11、计算机对接分析发现土木香内酯与UbcH5c的活性口袋具有很好的互补性,除了其分子中的α-亚甲基-γ内酯环与UbcH5c的Cys85形成共价键外,其分子中的酯氧基和羰基可以和UbcH5c中Cys85附近的残基Arg90发生氢键结合,从而有利于土木香内酯的"亲电弹头"α,β不饱和羰基与Cys85形成共价键;相反,异土木香内酯不能与UbcH5c蛋白的活性口袋形状匹配,其活性基团α,β不饱羰基无法与Cys85接近,因而异土木香内醋可能无法与UbcH5c蛋白共价结合。12、Western blot结果表明:在2.5-10μM范围内叁者均能有效的抑制TNF-α诱导的b.End3细胞内NF-κB通路活化,且土木香内酯的作用最强,异土木香内酯的作用最弱,土木香总内酯的作用介于二者之间。同时叁者均能抑制b.End3细胞中p38及JNK的磷酸化,说明叁者对MAPK通路活化均有抑制作用。13、以TNF-α刺激的HaCaT细胞为体外模型,检测土木香内酯、异土木香内酯及土木香总内酯对NF-κB信号通路活化及促炎细胞因子表达的影响,结果表明叁者均能有效抑制NF-κB通路活化及IL-1、IL-4、TNF-α表达。土木香内酯抑制作用最强,异土木香内酯作用最弱,而土木香总内酯的作用介于二者之间。14、以DNCB诱导的小鼠湿疹为体内模型进行土木香总内酯的抗湿疹作用评价,发现土木香总内酯以乳膏剂局部皮肤外用能够使DNCB诱导的小鼠背部湿疹症状得到明显改善,临床评分较模型组相比有显着下降,右耳肿胀程度明显减轻;HE染色结果显示给予土木香总内酯后,小鼠背部皮肤及右耳组织表皮增厚、角化过度,真皮层炎性细胞浸润的现象明显改善;ELISA结果表明皮炎小鼠血清中IgE、IFN-γ、TNF-α表达水平有显著降低。上述结果表明土木香总内酯对DNCB诱导的小鼠湿疹具有良好的防治作用。结论:本研究通过多重筛选分别从半合成以及天然的倍半萜内酯化合物中筛选出具有较强UbcH5c抑制活性的半合成化合物6d和高丰度天然化合物土木香内酷,证实了二者均能与UbcH5c直接结合,通过计算机虚拟对接推测了它们与UbcH5c的结合方式,并在细胞水平证明它们能够抑制TNF-α诱导的NF-κB通路活化同时能够下调多种促炎细胞因子的表达,最终以DNCB诱导的小鼠湿疹为动物模型完成了土木香总内酯的体内抗炎效应评价,发现土木香总内酷局部皮肤外用对DNCB诱导的小鼠湿疹的很好的防治作用。这些研究为以UbcH5c为靶点的新型抗炎药物的研发提供了候选化合物。(本文来源于《第二军医大学》期刊2016-05-01）
活性成分发现论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
大气污染物、环境毒物、氧化剂侵袭人体组织器官,引起氧化应激与炎症反应,进一步诱发慢性阻塞性肺病(COPD)等疾病,抑制氧化应激和炎症反应可有效干预COPD 病理进程。Nrf2(Nuclear factor-erythroid 2-related factor 2)通路是调控人体氧化还原平衡的关键通路,Nrf2通过编码Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶抑制氧化应激,调节机体氧化还原平衡;NF-κB(Nuclear factor κB)通路是调控人体炎症反应的关键通路,抑制NF-κκB能有效抑制机体炎症反应。因此,激活Nrf2通路和抑制NF-κκB通路,是抑制氧化应激与炎症反应的有效策略,是研发治疗COPD药物的重要途径。天然产物对人类药物发展史做出了重要贡献,从天然产物中寻找先导化合物和药物,是创新药物研发的重要途径。本文围绕“天然来源抗COPD活性成分发现及作用机制”方向,针对抑制氧化应激和炎症反应策略,完成了以下叁部分研究工作:第一部分:异黄酮7-MBA抑制氧化应激作用机制黄酮是一类重要的天然来源抗氧化剂,因其具有直接的自由基清除作用广受关注,但缺少黄酮通过上调抗氧化系统抑制氧化应激的系统性研究。课题组通过建立结构新颖多样的天然黄酮化合物库,采用NAD(P)H:醌还原酶(QR)诱导活性实验,筛选获得了具备强抗氧化应激活性化学组分——异黄酮7-MBA,并对此化合物开展了作用机制研究。发现:C①7-MBA能够上调NrfS、Ⅱ相脱毒酶:醌氧化还原酶1(NQO1)和抗氧化酶:γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)蛋白水平;②7-MBA通过作用于蛋白激酶促进Nrf2蛋白磷酸化修饰激活Nrf2通路;③7-MBA能够抑制Nrf2蛋白泛素化降解,延长Nrf2蛋白半衰期,增强Nrf2蛋白稳定性。申请人建立了砷诱导人肺上皮Beas-2B细胞氧化损伤模型,探究7-MBA对细胞氧化损伤的保护作用,发现:7-MBA能够上调细胞内源性抗氧化剂谷胱甘肽(GSH)水平,下调细胞内源性活性氧(ROS)表达,抑制砷诱导的Beas-2B细胞损伤凋亡,结果呈Nrf2依赖性。本研究工作确证了 7-MBA为新型异黄酮型Nrf2激动剂,探讨了其对COPD的预防治疗潜力。第二部分:芳樟抑制炎症反应活性成分发现及作用机制芳樟是我国传统药用植物,提取物具有抗炎活性,但目前并未见芳樟抗炎化学成分及作用机制研究报道。因此,课题组采用细菌脂多糖(LPS)诱导的小鼠RAW264.7巨噬细胞细胞炎症模型,开展了芳樟抗炎化学成分活性筛选和作用机制探究。首先,课题组通过对前期获取的25种芳樟化学成分进行抗炎活性筛选,确证了 8种天然化合物为芳樟植物抗炎活性分子,分别为:苯丙醇类、木脂素类、黄酮类、香豆素类和萜类化合物。其中,木脂素SMO和萜类化合物NLD首次被发现具有抗炎活性。因此,课题组对其开展了抗炎作用机制探究。发现:SMO和NLD能通过抑制NF-κB通路,下调肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)和前列腺素E2(PGE2)等炎症因子的表达,抑制LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、环氧合酶2(COX-2)和基质金属蛋白酶9(MMP-9)等炎症蛋白mRNA和蛋白水平的增加,缓解炎症反应,表现出防治炎症诱发相关疾病的活性潜力。本研究工作确定了苯丙醇类、木脂素类、黄酮类、香豆素类和萜类化合物为芳樟治疗炎症疾病的物质基础,发现了木脂素SMO和倍半萜NLD两个新型抗炎活性分子,阐明了抑制炎症反应的作用机制,确证了二者通过抑制炎症反应防治COPD的活性潜力。通过前面两部分研究工作,课题组分别从抗氧化应激和抗炎症反应两个角度,发现并探究了新型活性成分作用机制及干预COPD潜力。接下来,将进一步从氧化应激和炎症反应双重抑制角度寻找活性更强的先导化合物,为研发防治COPD药物奠定基础。第叁部分:滇南木姜子中氧化应激和炎症反应双重抑制活性成分发现及作用机制课题组前期研究发现,樟科木姜子属植物滇南木姜子提取物具有较强的氧化应激和炎症反应双重抑制活性,但目前尚无滇南木姜子化学成分和生物活性相关性研究报道。课题组通过QR和NO生成抑制实验,评价了从滇南木姜子中分离获得的22种化学成分的抗氧化抗炎活性,发现了 3-甲氧基-5-戊基苯酚(MPP)、5-羟乙基水杨酸、山奈酚和槲皮素,四种具有氧化应激和炎症反应双重抑制活性的化学组分。通过进一步开展MPP抑制氧化应激和炎症反应作用机制研究,发现:①MPP能够通过增加Nrf2蛋白稳定性、抑制Nrf2蛋白降解,上调Nrf2及其调控的Ⅱ相脱毒酶NQO1和抗氧化酶GCLM蛋白水平;②MPP能够抑制LPS诱导的NF-κB信号通路,干扰炎症基因表达。采用砷诱导的人肺上皮Beas-2B细胞损伤模型,评价了 MPP对抗氧化损伤作用潜力,发现MPP能够增加细胞内源性抗氧化剂GSH水平,抑制砷诱导Beas-2B细胞损伤和凋亡;采用LPS诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7炎症模型,评价了 MPP的抗炎作用,发现MPP能够通过上调NF-κB抑制蛋白IκBα水平抑制NF-κB亚基p65活化,降低炎症介质TNF-α,IL-1β和炎症相关蛋白iNOS,COX-2水平,抑制细胞炎性反应。本研究确定了 MPP、5-羟乙基水杨酸、山奈酚和槲皮素4种活性成分为滇南木姜子抑制氧化应激和炎症反应的物质基础。其中,MPP通过靶向Nrf2调控的抗氧化系统和NF-κB调控的炎症系统发挥氧化应激和炎症反应双重抑制作用,并能够抑制砷诱导的细胞损伤,具有成为防治COPD先导化合物的作用潜力。综上所述,本课题从抑制氧化应激和炎症反应角度,首次发现了四种具有干预COPD病理进程活性潜力的天然化合物,包括:异黄酮7-MBA、木脂素SMO、倍半萜NLD和酚类MPP,此外,课题组进一步确证了上述四种化合物抑制氧化应激和炎症反应的作用机制,为COPD干预药物研发奠定了研究基础。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
活性成分发现论文参考文献
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