论文摘要
脑肿瘤是成人危害性极大的恶性肿瘤之一，儿童因肿瘤而死亡的主要肿瘤类型，发病率和死亡率不断升高，严重的威胁着人类的健康和生命。在过去25年里，原发恶性脑肿瘤病人一直在增加，尤其在中年人以每年1.2％的速率在增加。2006年，在美国约有18120个新发脑肿瘤病人，其中约12820个死亡。多形性胶质母细胞瘤（gliobastona multiforme，GBM），颅内肿瘤分类属星形细胞瘤Ⅲ-Ⅳ级，是最常见的颅内原发肿瘤之一，约占成人因肿瘤而死亡总人数的2.3％。多形性胶质母细胞瘤病人占所有胶质瘤病人的一半以上，在北美每年约有8000到10000的新发病例，发病高峰多在45岁至55岁之间。近十年来，虽然对该肿瘤的病理生理特性有了进一步的理解，但是其治疗没有任何进展。经外科手术、甚至联合放疗与化疗，患者愈后仍很差，其中位生存期无明显改善，一般在9-12个月之间，且病人几乎无一例外的会出现肿瘤复发。最近研究发现，脑肿瘤中存在着具有干细胞自我更新特性的细胞亚群即脑肿瘤干细胞（Brain tumor stem cell，BTSC），是引发肿瘤并维持脑肿瘤生长的细胞来源（Tumor-initiating cell，TIC），肿瘤干细胞可耐化疗、耐放射，在肿瘤的复发过程中起着决定性的作用。BTSC是一群具有自我更新和重建原肿瘤组织表现型的肿瘤细胞，它具有三大特点即：无限增殖、自我更新、多潜能分化。在肿瘤球培养基（tumor sphere medium，TSM）培养条件下，可以形成典型的神经球样结构，并可表达一系列神经干细胞（Neural stem cell，NSC）特异性标记，如CD133、musashi、Nestin、bmi-1、PSP、melk等。在诱导分化条件下，可以分化表达神经元和胶质细胞标记的肿瘤细胞，其表现型与来源肿瘤样本相同。因此建立体外培养的恶性胶质瘤细胞系及分离培养肿瘤干细胞为进一步研究脑肿瘤的发病机制和细胞生物学特性，为探索新型药物治疗该肿瘤提供了一个较理想的实验模型。目的：1．建立GBM细胞系，初步探讨其生物学特性2．分离、培养及鉴定GBM肿瘤干细胞，初步探讨生物学特性方法：1．GBM原代细胞生长的体外培养条件优化进行GBM原代细胞培养时，分别采用不同的细胞分离、纯化方法和培养条件，优化最适合GBM的培养条件。分离方法优化：分别采用机械分离法、胰酶消化法；纯化方法优化：差异贴壁法、胶原酶消化法；培养条件优化：培养基分别使用DMEM、RPMI1640、DMEM／F12。2．建系细胞株生物学特性初步研究（1）体外实验研究：光镜、电镜下观察细胞形态及超微结构、MTT法检测细胞生长曲线及药物敏感性、克隆形成实验了解细胞增殖特性、染色体核型分析探讨细胞遗传学特性。（2）体内实验研究：裸鼠原位接种检测该细胞株的致瘤性，组织化学染色观察其病理学特性。3．GBM肿瘤干细胞分离、培养与鉴定通过条件培养基分离、培养GBM干细胞；细胞计数法、有限稀释实验及流式细胞仪对肿瘤干细胞进行鉴定；原位接种肿瘤干细胞于裸鼠检测该细胞的致瘤性，组织化学染色观察其病理学特性，进行体内鉴定。4．GBM肿瘤干细胞生物学特性的初步探讨通过RT-PCR比较单层贴壁生长肿瘤细胞与肿瘤干细胞相关基因表达的差异。通过流式细胞仪（flow cytometry，FCM）比较单层贴壁生长细胞与肿瘤干细胞细胞周期、细胞亚群（subpopulation，SP）细胞比例及CD133阳性细胞含量的差异。结果：1．原代GBM细胞分离培养条件：最适合的条件是机械分离法分离细胞后、差异贴壁与消化纯化法相结合纯化细胞、用含10％胎牛血清DMEM／F12培养基进行培养。2．GBM细胞系生物学特性的初步研究：（1）体外实验结果：光镜下GBM细胞系形态多样，细胞贴壁能力有所差异；电镜下胞核外形不规则，可见假性核内包涵体，核分裂易见；胞浆内细胞器明显增多，可出现发育不良的细胞器，也可见胶质丝；该细胞系群体倍增时间约为60h，克隆形成率为4.04％，以非整倍体核型为主，亚四倍体占分析核型的35％，余可见单倍体、超三倍体等核型；顺铂、鬼臼乙甙、丹参酮ⅡA对GBM细胞均有显著的细胞毒作用，并呈剂量和时间效应关系；DDP、VP-16、TANⅡA作用GBM细胞第三天，IC50分别为7.5mg／L、85mg／L、和0.12mg／L，差异有统计学意义（P＜0.01）。TANⅡA的细胞毒作用最强，其次为DDP，VP-16对细胞的抑制作用最小。（2）体内实验结果：1×105GBM细胞接种裸鼠可形成肿瘤，成瘤率为100％，且裸鼠肿瘤的病理组织形态及组织再培养细胞形态学观察与原有肿瘤组织及细胞相似，裸鼠移植瘤组织中表达胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）（+）与神经巢蛋白（Nestin）（+）。3．GBM肿瘤干细胞分离培养与鉴定：通过条件培养可分离培养出GBM肿瘤干细胞；BTSC具有自我更新能力；BTSC细胞生长周期约为150h，GBM中具有自我更新能力的细胞约占1.33％。肿瘤球中40.2％细胞表达CD133，9.1％的细胞为SP细胞。通过裸鼠原位接种结果显示：1000个GBM肿瘤干细胞接种裸鼠可形成肿瘤，成瘤率为50％，2万组GBM肿瘤干细胞接种裸鼠成瘤率为80％。移植瘤与人体来源的原发肿瘤组织病理表现型一致，表达CD133（+）、GFAP（+）及Nestin（+）蛋白。4．GBM肿瘤干细胞生物学特性的初步探讨与单层贴壁细胞比较，肿瘤干细胞乳腺癌耐药蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP）、CD133、Nestin、Wnt基因mRNA表达增强，GFAP、PTEN基因mRNA表达减弱（P＜0.05）。单层贴壁细胞与肿瘤干细胞细胞周期分布、SP细胞比例及CD133表达含量均有差异（P＜0.05）：肿瘤干细胞增殖指数为25.6％，处于G0／G1期细胞数为74.4％、SP细胞含量为9.1％、CD133+细胞含量40.2％；单层贴壁细胞增殖指数为34.6％，处于G0／G1期细胞数为65.4％、SP细胞含量0.1％、CD133+细胞含量1.3％。结论：1．成功的建立了GBM原代细胞系，优化了GBM原代培养条件。2．该细胞系倍增时间60h，克隆形成率为4.04％，以非整倍体核型为主，可异种移植成瘤，鼠瘤组织表达GFAP、Nestin蛋白，提示建系成功。可为进一步研究GBM的发病机制和细胞分子生物学特性提供较理想的体内外实验模型。3．顺铂、鬼臼乙甙、丹参酮ⅡA对该GBM细胞系均有显著的细胞毒作用，并呈剂量和时间效应关系，为研发新型药物治疗该肿瘤提供了实验依据。4．GBM肿瘤细胞中存在1.33％具有异常增殖能力的BTSC；可以利用条件培养基成功分离和培养BTSC；BTSC在TSM培养环境中可以增殖，形成连续传代的脑肿瘤干细胞球。5．BTSC表面标志物的检测：肿瘤球中40.2％的细胞为CD133阳性细胞，约9.1％的细胞为SP细胞。6．条件培养基培养后的GBM细胞仅1000即可在裸鼠原位成瘤；移植瘤与人体来源的原发肿瘤组织病理表现型一致，裸鼠移植瘤组织中表达CD133、GFAP及Nestin蛋白，可以作为研究GBM的动物模型。7．GBM干细胞与单层贴壁细胞相比生物学特性有所改变。相关基因表达的改变：与单层贴壁生长GBM细胞相比，BCRP-1、CD133、Nestin、Wnt mRNA表达较SSM培养细胞增强，GFAP、PTEN表达减弱；细胞周期分布、蛋白表达的改变：与单层贴壁细胞相比，GBM干细胞增殖指数降低，处于静止期细胞数量增加。SP细胞含量增加了91倍、CD133+细胞含量增加了30.92倍。体内成瘤活性增强。