论文摘要
人参（Panax ginseng C.A. Meyer）为五加科人参属多年生草本药用植物,是我国传统的名贵药材,被誉为“药中之王”。人参锈腐病是由人参锈腐病菌（Cylindrocarpon destructans （Zinns.） Scholten）引起的根部病害之一,平均发病率20%-30%,严重影响人参产量和加工质量,造成极大的经济损失。随着国际市场人参需求量的不断上升,人类健康意识和环保意识的增强,通过降低人参的农药残留、倡导安全无污染的GAP栽培模式来提高我国人参的市场竞争力已成为必然的发展趋势。利用植物诱导抗病性的原理来提高人参植株的抗性,利用分子检测手段对病害进行早期诊断和病菌种群动态监测,可能为人参锈腐病的防治提供一条新途径。本文以植物诱导抗病性为着眼点,从生理生化反应、差异蛋白质组学、分子检测等角度系统研究了外源化学诱导因子诱导人参抗锈腐病的机制,建立了人参锈腐病菌的分子检测体系,主要研究结果如下：1.明确了水杨酸、肉桂酸、阿魏酸、苯甲酸、对羟基苯甲酸和茉莉酸甲酯6种化学诱导因子对人参锈腐病菌的影响。通过在培养基内人工添加不同化学诱导因子培养人参锈腐病菌,来考察这些化学因子对人参锈腐病菌的影响。结果表明肉桂酸、阿魏酸、苯甲酸显著抑制人参锈腐病菌的菌丝生长和孢子萌发；水杨酸、茉莉酸甲酯在低浓度时不影响锈腐病菌的生长,浓度高于200μg mL-1时显著抑制其生长；而对羟基苯甲酸则对人参锈腐病菌没有影响。这些物质在人参锈腐病的化学诱导抗病性中发挥着重要作用。2.室内接种试验证明了水杨酸和茉莉酸甲酯在低浓度处理人参时可以对人参锈腐病菌产生诱导抗性。在所选用的6种化学诱导因子中,水杨酸和茉莉酸甲酯的诱抗效果最为显著。经200μg mL-1的水杨酸和茉莉酸甲酯处理后,不仅对人参生长有一定的促进作用,而且对人参锈腐病的防效分别达到了67.9%和56.6%。而其他几种化学因子对锈腐病的防效不显著,并会对人参生长产生不同程度的不良影响。因此,本文筛选水杨酸和茉莉酸甲酯作为进一步研究的化学诱导因子。3.首次证明了外源水杨酸（SA）和茉莉酸甲酯（MeJA）处理可以显著提高人参植株的诱导抗病性,并明确了其诱导人参抗人参锈腐病的生理生化机制。通过温室盆栽试验测定与抗性相关的生理生化指标发现,外源SA. MeJA能有效降低人参根内MDA含量和细胞膜电解质外渗率,提高脯氨酸和可溶性糖的含量及总酚含量,人参根系PAL、CAT、PPO、POD活性较对照均上升,p-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶活性也较对照增强,说明SA. MeJA诱导的植物抗病性可能与植物的系统获得抗性有关。外源施入SA和MeJA可减轻人参锈腐病的发病率和病害严重度,发病率分别下降了39.1%和34.8%,明显提高了人参植株抗性。SA诱导人参抗人参锈腐病的效果较MeJA更为显著,因此选择SA作为进一步研究人参锈腐病化学诱导抗性的诱导因子。4.采用植物组培技术,成功诱导出人参根愈伤组织并建立了生长旺盛的人参悬浮细胞系,为下一步运用SA诱导人参抗人参锈腐病的差异蛋白质组学研究提供了稳定、均一的试验试材。愈伤组织诱导选用MS培养基,外源激素种类及浓度为3mg/L2,4-D和0.2mg/L KT,培养基蔗糖浓度为0.8%,pH值在5.8-6.0之间。继代培养添加的激素配比及浓度为2mg/L2,4-D和0.5mg/L BA。悬浮细胞液体培养基的激素浓度及配比与愈伤组织继代培养基的激素水平相同,人参悬浮细胞于摇床悬浮振荡培养,培养条件为110rpm,24±2℃5.首次采用蛋白质组学分析方法对SA诱导人参抗人参锈腐病的差异蛋白组进行了分析,明确了SA对人参抗锈腐病蛋白表达的调控作用。建立了适合人参悬浮细胞蛋白质组学分析的高通量、高分辨率的双向电泳技术体系：采用改良酚提取法制备人参悬浮细胞总蛋白,裂解缓冲液为9M尿素、2M硫脲、2%IPG Buffer、4%CHAPS、1%TBP.65mMDTT, pH5-8IPG胶条,SDS-PAGE分离胶浓度为12%。通过双向电泳技术获得了清水对照、SA处理、C. destructans处理及SA+C. destructans处理的人参悬浮细胞蛋白2-DE图谱。在凝胶上分别检测到800多个蛋白点。对蛋白质丰度变化在2倍以上、重复性好的24个差异表达蛋白点进行MALDI-TOF-MS质谱鉴定分析,其中共成功鉴定了23个蛋白点,去掉重复的蛋白共鉴定出22种蛋白质。在这些鉴定的蛋白点中,以对照为参考胶,只在SA处理中上调表达的蛋白点有12个,下调表达的蛋白点2个,特异表达的蛋白点1个；只在SA+C.destructans处理中上调表达的蛋白点2个,下调表达的蛋白点1个；,在三个处理中都上调表达的蛋白点5个,下调表达的蛋白点1个。这些特异表达的蛋白涉及植物自身的防卫反应、信号转导、能量代谢和转录调控等方面。其中热激蛋白60、肉桂醇脱氢酶、单脱水抗坏血酸还原酶、甲氧基转移酶都与防御反应正相关。6.首次建立了人参锈腐病菌分子检测体系,为人参锈腐病的早期诊断和病原菌种群动态监测奠定了理论基础。该体系在对人参锈腐病菌ITS区进行PCR扩增、测序及序列分析基础上,设计了特异性引物CD-F/CD-R,可以用于人参主要病原真菌及常见土壤习居菌的PCR检测。只有以C. destructans基因组DNA为模板的体系中能扩增出一条450bp左右的条带,而其他菌株及阴性对照均无特异性条带产生。利用该特异性引物能从罹病组织和人工接种C. destructans的土壤DNA中扩增出特异性条带,而对照及健康人参组织均无扩增产物,表明该特异性引物可以用于人参锈腐病菌的分子检测和早期诊断。