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高含油微藻选育与DGAT2基因功能研究

2020-12-11阅读(708)

高含油微藻选育与DGAT2基因功能研究

论文摘要

微藻是一类在陆地、海洋广泛存在,光合利用度高的自养植物。微藻作为-种低等植物,其最大特点是种类繁多、分布广泛,繁殖快速。微藻含有十分丰富的甘油以及酯类,因此微藻可作为制备生物柴油的优良原材料。作为微藻产油丌发和利用的前提：理想藻种的选育、改造以及藻种最佳培养条件,都已成为国内外普遍关注的研究课题。自然环境中存在丰富的藻种资源,因此直接从中筛选出理想的藻株是目前使用的最为广泛地筛选方式之一。本实验用已从自然环境中筛选出的高含油藻株微芒藻Micractinium pusillum Y-002为实验材料,通过形态学与分子生物学相结合的方法,对其进行了种属分类。培养基成分对微藻的油脂积累有很大的影响。实验通过四种不同培养基（TAP、HSM、SE和BG11）营养黼限制的培养条件下,培养微芒藻Micractinium pusillum Y-002,用以观测微藻的生长及油脂积累情况。结果表明：缺氮培养时,微藻中性脂的含量在不同培养基中均有提升（2-8倍）,其中高碳培养基HSM-N中·性脂含量超过一般HSM含量的十倍以L。而缺铁培养对中性脂的积祟效果不明显。然而无论缺乏何种营养元素都将显著地降低生i物量的增长。通过物理、化学和生物等人工诱变的方法去寻找理想藻株是另一种筛选藻株的方式。本实验以模式藻株莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii CC425插入突变人工诱变的方法去寻找理想藻株。以HSM和HSM-N培养基中筛选出油脂含量同时升高的突变株1株。在HSM培养基中筛选出突变株CC425-M23,中性脂含量与野生型CC425相比提高了170%,达到细胞干重的17%‰在HSM-N培养基中突变株,中性脂含量分别提高了14%、10%,达到61%、42%。利用生物基因工程和生物代谢工程等手段“人工制造”工程藻株,是第三种筛选藻株的方式。实验克隆了影响TAG合成代谢的关键基因CrDGAT基因的部分片段,构建了CrDGAT基因的RNAi表达载体。转化莱茵衣藻Chlamydomonas reinhardtii CC425,结果表明在预测的5种CrDGAT基因中只有沉默CrDGAT-1和CrDGAT-5基因后,中性脂含量才会显著下降。在HSM中,中性脂含量分别下降15%和27%,而HSM-N中基因沉默转化子死亡。说明CrDGAT-1和CrDGAT-5基因才是真正的具有表达合成TAG限速酶的基因。实验构建CrDGAT基因过量表达载体,过量表达CrDGAT-1和CrDGAT-5基因,并且进行CrDGAT基因的亚细胞定位。结果是用HSM-N培养整个过程中,过量表达转化子的中性脂含量与野生型CC425相比均提高20%-40%,最大中性脂含量分别为59%和50%‰CrDGAT基因的亚细胞定位结果显示,CrDGAT-1和CrDGAT-5基因是在细胞质内表达的。目前在研究微藻选育方面,主要有以上三种方式。本实验通过这三种方式,寻找理想的产油藻种。并探索可能的CrDGAT基因作用机理以及作用场所。这为继续研究微藻产油的机理打下基础。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 本论文的创新点
  • 一、文献概述
  • （一） 传统化石燃料与生物柴油
  • （二） 生物柴油与油脂原料
  • （三） 生物柴油与微藻产油
  • 1、微藻生产生物柴油的历史沿节
  • 2、微藻产油的技术环节
  • 2.1、理想藻种的选育
  • 2.2、产油微藻的培养条件
  • 2.3、培养方式对油脂积累的影响
  • 2.4、产汕微藻培养技术的改良
  • （四） 二酰基甘油酰基转移酶:一个催产合成三酰甘油的关键酶素
  • 1、DGAT2基因的发现
  • 2、DGAT2基因的结构
  • 3、DGAT的亚细胞定位
  • 4、DGAT的功能
  • （五） 基因沉默、过量表达与亚细胞定位
  • 1、RNAi的发现
  • 2、RNAi的机制
  • 3、RNAi在微藻性状改良中的应用
  • （六） 本研究的目的意义
  • 二、微藻产油策略一:微藻选育和营养盐限制培养
  • （一） 材料与方法
  • 1.1、培养基
  • 1.2、仪器
  • 1.3、藻种的采集和分离纯化
  • 1.4、藻株、菌株的培养条件
  • 1.5、生物量、细胞干重、水溶蛋白、总糖统计和中性脂的观测
  • 1.5.1、生物量的统计
  • 1.5.2、微藻干重的测量
  • 1.5.3、水溶蛋白的测量
  • 1.5.4、总糖测定
  • 1.5.5、使用尼罗红荧光法计算中性脂含量
  • 1.6、Y-002的18S rDNA基因克隆及序列分析
  • 1.6.1、降落PCR
  • 1.6.2、大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备
  • 1.6.3、重组质粒构建
  • 1.6.4、热激转化重组质粒
  • 1.6.5、同源比对
  • 1.7、营养盐限制培养下Y-002生长周期和中性脂积累的观测
  • 1.7.1、TrAP,HSM,SE和BG11的氮、铁、磷、硫、钾、镁和钙限制培养
  • 1.7.2、低碳培养基在氮缺乏下添加额外碳源培养
  • （二） 结果与分析
  • 2.1、三酰甘油含量标准曲线
  • 2.2、水溶蛋白,总糖含量标准曲线
  • 2.3、Y-002的18S rDNA分析
  • 2.4、营养元素的限制对Y-002生长和油脂积累的影响
  • 2.5、高碳培养基HSM在氮、硫、磷的限制培养对细胞干重,蛋白质,糖含量的影响
  • 2.6、高碳培养基SE-N增加碳含量对Y002培养的影响
  • （三） 讨论
  • 三、微藻产油策略二:人工诱变育种
  • （一） 材料与方法
  • 1.1、培养基
  • 1.2、仪器
  • 1.3、试剂
  • 1.4、藻株筛选及培养条件
  • 1.5、菌株与质粒
  • 1.6、玻璃珠转化莱茵衣藻
  • 1.7、转化子的筛选
  • （二） 结果与分析
  • 2.1、线性化质粒pSP124S
  • 2.2、突变株的生长和油脂积累
  • （三） 讨论
  • 四、微藻产油策略三（上）:产油相关基因筛选--CrDGAT基因沉默
  • （一） 材料与方法
  • 1.1、培养基
  • 1.2、仪器
  • 1.3、藻株筛选及其生长条件
  • 1.4、获取莱茵衣藻CC425的cDNA
  • 1.5、CrDGAT基因的克隆与RNA干扰载体的构建
  • 1.5.1、CrDGAT基因的克隆
  • 1.5.2、RNAi中间载体的构建
  • 1.5.3、RNAi反向重复片段的克隆
  • 1.5.4、RNAi反向重复结构的构建
  • 1.5.5、Maa7/XIR载体去磷酸化
  • 1.5.6、RNAi载体的构建
  • 1.6、电击转化莱菌衣藻CC425
  • 1.7、莱茵衣藻CC425转化子的筛选及检测
  • （二）结果与分析
  • 2.1、获取莱茵衣藻CC425的cDNA基因序列
  • 2.2、获取CrDGAT的cDNA基因序列
  • 2.3、RNAi反向重复片段
  • 2.4、RNAi中间载体
  • 2.5、RNAi反向重复结构的构建
  • 2.6、siRNA表达载体的构建
  • 2.7、莱茵衣藻CC425转化子的筛选
  • 2.8、转化子中性脂含量的检测
  • （三） 讨论
  • 五、微藻产油策略三（下）:CrDGAT过量表达与亚细胞定位
  • （一） 材料与方法
  • 1.1、材料与仪器
  • 1.1.1、试剂
  • 1.1.2、质粒
  • 1.1.3、PCR引物
  • 1.1.4、培养基
  • 1.1.5、仪器
  • 1.2、方法
  • 1.2.1、过量表达与亚细胞定位基因片段PCR扩增
  • 1.2.2、质粒DNA的酶切
  • 1.2.3、质粒片段的连接
  • 1.2.4、重组质粒的转化
  • 1.2.5、菌株的培养
  • 1.2.6、重组质粒的鉴定
  • 1.2.6.1、酶切鉴定
  • 1.2.6.2、重组质粒的测序
  • 1.3、过量表达对藻株中性脂含量的影响
  • 1.4、CrDGAT亚细胞定位
  • 1.4.1、CrDGAT在藻株中的亚细胞定位
  • 1.4.2、基因枪轰击洋葱表皮细胞
  • 1.4.2.1、微弹制备
  • 1.4.2.2、DNA的包裹
  • 1.4.2.3、基因枪的操作步骤
  • 1.4.3、绿色荧光蛋白的观测
  • （二） 结果与分析
  • 2.1、CrDGATs基因表达载体的构建
  • 2.1.1、重组质粒的酶切鉴定
  • 2.1.2、pGEX-6p-1和pCAMBIA1302载体及CrDGAT位点
  • 2.1.3、pGEX-6p-1的过量表达
  • 2.2、CrDGAT-1-pCAMBIA1302与CrDGAT-5-pCAMBIA1302的亚细胞定位
  • 2.2.1、CrDGAT-1与CrDGAT-5在洋葱细胞的亚细胞定位
  • 2.2.2、CrDGAT-1与CrDGAT-5在衣藻CC425中的细胞定位
  • （三） 讨论
  • 结论
  • 参考文献
  • 后记

    • 相关论文文献

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