携带IL-15的T细胞对肝癌细胞的体外杀伤研究

论文摘要

肿瘤浸润淋巴细胞（tumor-infiltrating lymphocyte, TIL）是脱离血流后迁移至肿瘤组织的白细胞,主要由T细胞、B细胞和NK细胞组成。TIL对黑素瘤的过继治疗取得了很好的效果,而对肝癌的疗效并不理想,这可能与肝癌内TIL相对少见以及调节性T细胞的免疫抑制有关。TIL的分离和扩增方法以及快速扩增（rapid expansion procedure, REP）所需的大量IL-2和饲养细胞限制了这种过继治疗在世界范围内的推广IL-15具有刺激T细胞增殖,调节B细胞增殖和分化,提高NK细胞的杀伤活性并维持其存活,诱导细胞毒性T细胞的产生和杀伤活性,抑制活化T细胞的凋亡等功能。另外,IL-15可通过活化磷脂酰肌醇-3-激酶途径使淋巴细胞能抵抗调节性T细胞的抑制作用。本研究利用携带IL-15基因的嵌合型腺病毒-腺相关病毒杂合载体Ad5/35.AAV-hIL-15转染TIL表达IL-15。5/35嵌合型腺病毒可以有效转染T细胞和NK细胞,AAV反向末端重复序列（inverted terminal repeat, ITR）的引入可以使目的基因在细胞内持续稳定表达,突变胸苷激酶（thymidine kinase, TK）基因的表达可以使细胞在加入丙氧鸟苷（gancyclovir,GCV）后发挥自杀功能。本研究用组织块培养获得了“年轻”TIL,并对TIL REP中抗CD3单克隆抗体（OKT3）、IL-2及饲养细胞的用量进行了试验性摸索,发现OKT3用量增加并不会显著提高TIL的扩增倍数,而采用3000IU/ml IL-2或50倍于TIL的饲养细胞的扩增倍数分别与6000IU/ml和200倍的相当。最终,选择30ng/ml OKT3、3000IU/ml IL-2和50倍的饲养细胞进行TILREP,扩增达4000倍以上。若用于REP的TIL细胞数不少于5×107,那么理论上扩增后TIL可达到2×1011以上对含IL-15基因的质粒进行PCR,得到的目的基因产物与质粒pDC759-TV1经EcoRI和BamHI酶切后连接,成功构建了质粒pDC759-hlL-15。质粒鉴定正确后与含35型腺病毒纤毛的腺病毒骨架质粒共转染293细胞,同源重组产生杂合病毒Ad5/35.AAV-hIL-15。该病毒充分结合了腺病毒和AAV的优势,能有效转染T细胞并稳定表达IL-15。采用CopGFP报告基因证实了载体Ad5/35.AAV对TIL的转染效率明显高于Ad5.AAV。ELISA检测到病毒Ad5/35.AAV-hlL-15转染的TIL有目的蛋白IL-15的表达。MOI=1、10时病毒Ad5/35.AAV-hIL-15可促进TIL增殖,MOI=100时则对增殖不利。加入GCV后,观察病毒Ad5/35.AAV-TK-CopGFP转染的SMMC-7721的绿色荧光及细胞形态,MTT法检测病毒转染后TIL的增殖情况,最终确认了病毒转染后突变TK的表达及其自杀功能。MOI=1、10时病毒Ad5/35.AAV-hIL-15转染的TIL对肝癌细胞SMMC-7721的杀伤活性显著增强。目前已完成大部分体外实验研究,还需用大规模REP检验初步优化的扩增条件。用流式细胞术检测TIL表型,弄清REP及病毒转染对TIL的影响。从肝癌组织建立原代细胞系,用对应的TIL在病毒转染后进行体外及小鼠荷瘤模型的杀伤实验。这些都是接下来要进行的工作。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 目录
• 缩略词表
• 第一章 引言
• 1 TIL的研究现状
• 1.1 TIL的分离技术
• 1.2 TIL的扩增方法
• 1.3 TIL的抗瘤作用及其机制
• 1.4 TIL细胞表型
• 1.5 TIL抗肿瘤免疫困境
• 2 肝癌的TIL过继治疗
• 2.1 限制肝癌TIL过继治疗的因素
• 2.2 肝癌TIL过继治疗的预后
• 2.3 肝癌免疫治疗的新方向
• 3 本课题要解决的问题及研究目的
• 3.1 课题设计的出发点
• 3.2 课题的研究目的
• 第二章 肝癌“年轻”TIL的建立及其快速扩增
• 1 前言
• 2 实验器材
• 2.1 实验材料
• 2.2 所需的主要仪器
• 2.3 主要试剂
• 2.4 主要试剂的配制
• 3 方法
• 3.1 “年轻”TIL的分离
• 3.2 TIL的快速扩增
• 3.3 TIL快速扩增条件的优化
• 4 结果
• 4.1 “年轻”TIL的建立
• 4.2 不同TIL的小规模快速扩增
• 4.3 OKT3对TIL扩增的影响
• 4.4 IL-2对TIL扩增的影响
• 4.5 饲养细胞对TIL扩增的影响
• 5 讨论
• 6 小结
• 第三章 携带hIL-15的腺病毒-腺相关病毒杂合载体的构建
• 1 前言
• 2 实验器材
• 2.1 实验材料
• 2.2 主要的实验仪器与设备
• 2.3 主要试剂
• 2.4 主要试剂的配制
• 2.5 所需引物
• 3 方法
• 3.1 pDC759-hIL-15载体构建
• 3.2 质粒pDC759-hIL-15的大量制备及鉴定
• 3.3 病毒重组、扩增和纯化
• 3.4 病毒滴度的测定
• 4 结果
• 4.1 用于质粒pDC759-hIL-15构建的各目的片段的电泳结果
• 4.2 重组腺病毒的鉴定
• 4.3 病毒滴度测定
• 5 讨论
• 6 小结
• 第四章 携带hIL-15的杂合病毒转染TIL及其对肝癌细胞的体外杀伤
• 1 前言
• 2 实验器材
• 2.1 实验所需材料
• 2.2 实验所需仪器
• 2.3 实验所需主要试剂
• 2.4 主要试剂的配制
• 3 实验方法
• 3.1 细胞培养
• 3.2 携带CopGFP基因的病毒转染TIL
• 3.3 ELISA法检测目的蛋白的表达量
• 3.4 病毒转染的TIL体外增殖活性的检测
• 3.5 TK基因自杀功能的检测
• 3.6 肝癌原代细胞的建立
• 3.7 病毒转染TIL对肝癌细胞的杀伤
• 4 实验结果
• 4.1 病毒转染TIL后绿色荧光的观察
• 4.2 病毒转染后IL-15的表达量
• 4.3 病毒转染对TIL增殖的影响
• 4.4 TK基因的自杀功能
• 4.5 肝癌原代细胞的分离
• 4.6 病毒转染的TIL对肝癌细胞的杀伤
• 5 讨论
• 6 小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 附录1 实验流程图
• 附录2 载体pDC759-hIL-15的构建流程