PRRSV Shaanxi-1株分离鉴定、全基因测序及遗传进化分析

论文摘要

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）也称猪蓝耳病,是由动脉炎病毒科动脉炎病毒属的猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）引起的一种严重的病毒性传染病,该病以引起母猪的繁殖障碍、仔猪和育成猪呼吸道症状及高死亡率为主要特征。自1987年首次发现以来,该病广泛流行于世界各主要养猪国家及地区,现已成为威胁养猪业的主要疫病之一。2006年以来,由该病毒变异株引起的高致病性猪蓝耳病（Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome,HP-PRRS）在我国广泛流行给养猪业带来了巨大的损失。对近年来分离的PRRSV的序列和抗原分析发现,不同分离株间在毒力、基因序列和抗原性方面都存在着较大的变化。本研究从陕西省华县某猪场疑似PRRS的病死猪上采集病料,进行了病毒的分离,经鉴定成功分离到一株PRRSV,对其全基因组进行克隆、测序及遗传进化分析,以期揭示陕西省PRRS病原的变异与“高热病”发生的关系,为陕西省PRRS的流行病学调查及PRRSV的致病机制的研究奠定基础。研究主要内容如下:l.PRRSV的分离鉴定从陕西省华县某猪场疑似高热病的病死猪上采集病料,在Marc-145传代细胞上进行病毒分离。将病毒接种Marc-145后,盲传至第2代,细胞出现病变,第3代出现明显CPE。分离毒株对Marc-145细胞表现强嗜性。中和试验表明,用PRRSV高免血清中和后的病料处理液不能使Marc-145出现典型的CPE现象。用PRRSV美洲株抗M蛋白的单抗做间接免疫荧光染色（IFA）试验,结果表明接种病毒的Marc-145细胞镜检时可见特异的绿色荧光。利用PRRSV Nsp2变异区片段的特异性引物,从采集的病料中及产生CPE的Marc-145细胞处理液中均扩增出了与Nsp2缺失株预期片段大小相符的片段,与阳性对照美洲型变异株JXA1扩增结果一致。综合结果表明分离到一株美洲型PRRSV变异株,将其命名为PRRSV Shaanxi-1。2.PRRSV全基因组的克隆及测序根据VR-2332和HB-1（sh）/2002序列分段设计引物,用Marc-145细胞增殖的第3代病毒提取RNA,应用RT-PCR方法扩增家猪源PRRSV Shaanxi-1各段基因,将其连入pMD18-T载体,连接产物转化DH5α感受态细胞。经菌液PCR及质粒酶切鉴定,筛选出含阳性重组质粒的菌液,送南京金思特生物技术有限责任公司进行测序。测序结果用Blast和DNAStar 5.0软件进行分析。结果表明Shaanxi-1基因全长15323bp（不包括poly（A）尾）,Shaanxi-1株与JXA1、HUN4和jiangxi-3等HP-PRRSV株全长及各片段长度完全一致,与以前流行的中国毒株CH-la、HB-l（sh）/2002以及其他美洲株存在一定的差异,主要表现在5 UTR,ORF1a和3 UTR区域。3.PRRSV全基因组的遗传特征分析根据各片段之间相重叠的区域,用DNAStar将各序列依次拼接获得完整的全基因,将其与GenBank中发表的典型毒株的基因序列进行比对,分析Shaanxi-1的分子生物学特征,建系统进化树,分析Shaanxi-1的遗传变异。分析结果显示,Shaanxi-1与美洲型毒株的亲缘关系较近,与2006年以后国内分离的HP-PRRSV毒株同源性最高,核苷酸同源性保持在98.0%以上。美洲型毒株依据ORF5序列可初步划分为2个亚群,Shaanxi-1、Shaanxi-2（野猪源PRRSV）与JXA1、Henan-1、HuN4、HUB2和CH-la等毒株的遗传距离较近,属于同一个亚群。Shaanxi-1符合HP-PRRSV的分子特征:5’UTR第120位出现碱基“A”的缺失,3’UTR第19位出现碱基“G”的缺失,Nsp2区段第481位出现一个“L”氨基酸的缺失及532560位出现连续29个氨基酸的缺失。与PRRSV毒力相关的9个氨基酸比对发现在这些位点上Shaanxi-1与HP-PRRSV的保持高度一致,且与疫苗株、传统弱毒株有明显的差异。但Shaanxi-1 ORF2 S23、ORF3 L143S248、ORF4 I66P67以及Shaanxi-2 Nsp2 G191、ORF2 F50、ORF3 A225、ORF4 G43 I66、ORF7 R48S49这些位点与疫苗株及传统弱毒株保持相同,与HP-PRRSV毒株不同。本研究对陕西省华县某猪场疑似高热病的发病猪上分离的PRRSV Shaanxi-1毒株进行了全基因测序,并与陕西省野生动物园分离的野猪源性PRRSV毒株Shaanxi-2以及其他典型毒株进行了比对分析,结合本实验室对Shaanxi-1和Shaanxi-2对仔猪的致病性试验,对Shaanxi-1和Shaanxi-2变异株病原特征与猪高热病发生的关系有了进一步的了解,同时丰富了PRRSV基因库资源,为后续深入研究PRRSV基因功能,揭示PRRSV致病的分子机制,研制PRRSV基因疫苗,以及有效的防控PRRS奠定基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 第一章 PRRSV 的基本特征与感染性克隆的研究进展
• 1.1 PRRSV 的基本特征
• 1.1.1 PRRSV 的形态特征
• 1.1.2 PRRSV 的繁殖与复制
• 1.1.3 PRRSV 的理化特性
• 1.1.4 PRRSV 的培养特性
• 1.1.5 PRRSV 基因组结构特征
• 1.1.6 PRRSV 基因组编码产物及功能
• 1.1.6.1 病毒基因组编码的非结构蛋白和功能
• 1.1.6.2 病毒基因组编码的次要结构蛋白和功能
• 1.1.6.3 病毒基因组编码的主要结构蛋白和功能
• 1.2 PRRSV 感染性克隆的研究
• 1.2.1 病毒反向遗传操作原理
• 1.2.2 构建病毒基因组全长cDNA 克隆
• 1.2.3 感染性转录物的产生
• 1.2.3.1 体内转录
• 1.2.3.2 体外转录
• 1.2.4 感染性克隆的产生与鉴定
• 1.2.5 病毒的拯救
• 1.2.6 PRRSV 感染性克隆的历史和发展
• 1.3 结语
• 试验研究
• 第二章 PRRSV SHAANXI-1 株的分离与鉴定
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 主要试验仪器
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 试验病料
• 2.1.4 试验细胞、高免血清及单抗
• 2.1.5 主要试剂的配制
• 2.1.5.1 细胞培养相关试剂的配制
• 2.1.5.2 琼脂凝胶电泳相关试剂的配制
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 引物设计
• 2.2.2 病料的采集及处理
• 2.2.3 细胞培养
• 2.2.4 病毒的增殖
• 2.2.5 RT-PCR 检测
• 2.2.5.1 病毒总RNA 的提取
• 2.2.5.2 RT-PCR 反应
• 2.2.6 病毒中和试验
• 50 测定'>2.2.7 TCID₅₀测定
• 2.2.8 间接免疫荧光检测
• 2.3 结果
• 2.3.1 病料RT-PCR 检测结果
• 2.3.2 病毒分离结果
• 2.3.3 血清中和试验结果
• 2.3.4 RT-PCR 鉴定病毒增殖结果
• 50 测定结果'>2.3.5 TCID₅₀测定结果
• 2.3.6 间接免疫荧光检测结果
• 2.4 讨论
• 2.4.1 PRRSV 的流行情况
• 2.4.2 病料组织的选择
• 2.4.3 病毒的分离培养与鉴定
• 2.5 小结
• 第三章 PRRSV SHAANXI-1 株全基因组序列扩增与测定
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 毒株、菌株、载体与细胞
• 3.1.2 主要仪器
• 3.1.3 试剂和耗材
• 3.1.4 试验相关试剂的配制
• 3.1.4.1 细胞培养相关试剂的配制
• 3.1.4.2 RT-PCR 相关试剂的配制
• 3.1.4.3 细菌培养基的配制
• 3.1.5 分子生物学分析软件
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 PRRSV 病毒的增殖
• 3.2.2 引物设计
• 3.2.3 PRRSV 感染的Marc-145 细胞中病毒总RNA 的提取
• 3.2.4 全基因RT-PCR 扩增
• 3.2.5 PCR 产物的纯化及cDNA 片段的回收
• 3.2.6 纯化产物与pMD-18T Vector 连接
• 2 法）'>3.2.7 感受态细胞的制备（CaC1₂法）
• 3.2.8 连接产物的转化
• 3.2.9 重组质粒的提取
• 3.3.10 重组质粒的PCR 鉴定
• 3.3.11 重组质粒的酶切鉴定
• 3.2.12 重组质粒的测序分析
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 PRRSV Shaanxi-1 株全基因RT-PCR 扩增
• 3.3.2 全基因序列拼接结果
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 第四章 PRRSV SHAANXI-1 基因组分子遗传特征分析
• 4.1 材料
• 4.1.1 PRRSV 基因组全长序列来源
• 4.1.2 分子生物学分析软件
• 4.2 方法
• 4.2.1 PRRSV Shaanxi-1 株基因组序列比对分析
• 4.2.2 PRRSV Shaanxi-1 基因组进化树分析
• 4.2.3 RRSV Shaanxi-1 株毒力相关氨基酸的推测与变异分析
• 4.3 结果
• 4.3.1 PRRSV Shaanxi-1 株基因组序列比对分析结果
• 4.3.1.1 5’UTR 和3’UTR 序列分析
• 4.3.1.2 非结构蛋白的结果与分析
• 4.3.1.3 Nsp2 的结果与分析
• 4.3.1.4 结构蛋白的序列分析
• 4.3.1.5 GP2
• 4.3.1.6 GP3
• 4.3.1.7 GP4
• 4.3.1.8 GP5
• 4.3.1.9 M
• 4.3.1.10 N
• 4.3.2 PRRSV Shaanxi-1 株毒力相关氨基酸的变异分析结果
• 4.3.3 全基因的系统进化分析
• 4.4 讨论
• 4.4.1 Shaanxi-1 株 5’UTR 及 3’UTR 的遗传变异
• 4.4.2 Shaanxi-1 株非结构蛋白的遗传变异
• 4.4.3 Shaanxi-1 株结构蛋白编码区的遗传变异
• 4.4.4 PRRSV Shaanxi-1 和 Shaanxi-2 毒株致病性分析
• 4.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 英文缩略词及中英文对照
• 致谢
• 作者简介